[发明专利]一种用于检测KRAS基因突变的核苷酸序列组及其应用

说明书

本发明公开了一种核苷酸序列组，包括正向引物和反向引物，用于扩增含有突变型KRAS基因的一部分；正向引物的3’末端对应突变型KRAS基因正义链中突变位点、突变位点向正义链5’端10个碱基以及突变位点向正义链3’端10个碱基中任何一个碱基的位置；或者反向引物的3’末端对应突变型KRAS基因反义链中突变位点、突变位点向反义链5’端10个碱基以及突变位点向反义链3’端10个碱基中任何一个碱基的位置。该核苷酸序列组还包括阻断核苷酸序列。采用本发明的核苷酸序列组，配合荧光定量PCR检测方法，可以将KRAS突变基因的检测灵敏度提升至0.01％。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种用于基因突变检测的核苷酸序列组及其应用。

背景技术

ras基因家族中，与人类肿瘤相关的有HRAS、KRAS和NRAS，其中，KRAS对人类癌症影响最大。KRAS基因定位于12号染色体上，KRAS基因参与细胞内的信号传递。正常生理情况下，在细胞受到外界刺激后激活EGFR等信号通路时，野生型的KRAS被活性EGFR等酪氨酸激酶磷酸化后短暂活化，活化后的KRAS可以激活该信号通路中的下游信号蛋白，而后KRAS迅速失活。突变型KRAS蛋白导致蛋白功能异常，在无EGFR活化信号刺激下仍处于激活状态，导致肿瘤的持续增殖。KRAS的基因突变常见于肺癌、结直肠癌、腺癌等多种恶性肿瘤，在肺癌中的突变率为15～30％，在结直肠癌患者中的突变率为20～50％，与肿瘤细胞的生存、增殖、迁移、扩散、血管生成均有关系。检测KRAS基因突变是深入了解癌基因的情况、了解各种癌症的发展预后、放化疗疗效的重要指标。

现有的KRAS基因突变检测方法中，组织活检侵袭性大，样本获取难度大，且异质性表现明显。测序法实验操作复杂，数据分析难度较大，成本较高，且检测周期长，很难满足临床需求。而基于循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)的液体活检技术，可以非侵入的方式对肿瘤相关基因突变进行检测，而且患者普遍更容易接受非侵入性的样本采集方式。但是血清/血浆中ctDNA含量低，比如在肿瘤早期阶段，ctDNA仅占总游离DNA的0.01％，因此，常用的检测方法比如测序法和扩增阻碍突变系统法(amplification refractorymutation system，ARMS)的检测灵敏度无法完成有效检测。

因此，本领域技术人员致力于开发一种提高KRAS基因突变检测灵敏度的方法。

发明内容

有鉴于现有技术中活检侵袭性大、测序法操作复杂、成本高及周期长以及常规荧光定量PCR检测方法灵敏度仅能达到1％的缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种提高KRAS基因突变检测灵敏度的方法。

为实现上述目的，本发明的一个方面提供了一种核苷酸序列组。在一个具体实施方式中，该核苷酸序列组包括正向引物和反向引物，用于扩增含有突变型KRAS基因的一部分；正向引物的3’末端对应突变型KRAS基因正义链中突变位点、突变位点向正义链5’端10个碱基以及突变位点向正义链3’端10个碱基中任何一个碱基的位置；或者反向引物的3’末端对应突变型KRAS基因反义链中突变位点、突变位点向反义链5’端10个碱基以及突变位点向反义链3’端10个碱基中任何一个碱基的位置。

可选地，正向引物或反向引物上包括人为突变位点，人为突变位点使得正向引物与突变型KRAS基因的反义链不能完全互补；或者人为突变位点使得反向引物与突变型KRAS基因的正义链不能完全互补。

可选地，人为突变位点位于距正向引物3’端1-10个碱基中任何一个的位置；或者人为突变位点位于距反向引物3’端1-10个碱基中任何一个的位置。

在另一个具体实施方式中，核苷酸序列组还包括阻断核苷酸序列，阻断核苷酸序列对应于所述突变位点处的一段野生型KRAS基因，能减少或阻止所述正向引物或所述反向引物对野生型KRAS基因的扩增