[发明专利]一种草坪草种子组培外植体消毒的方法

说明书

本发明涉及一种草坪草种子组培外植体消毒的方法，包括以下步骤：A、选取需进行愈伤组织诱导的草坪草种子，将其加入浓硫酸中进行振荡处理，去除颖壳；B、将去除颖壳的草坪草种子取出，置于水中，反复清洗残留的酸液；C、将经B处理后的草坪草种子进行灭菌处理，然后清洗得无菌草坪草种子。本发明采用浓硫酸把草坪草种子外的颖壳碳化掉，再用超纯水反复冲洗，大幅节省手工剥除或用砂布打磨去除种子颖壳的时间，且草坪草种子愈伤组织诱导的培养基基本达到零污染。

技术领域

本发明涉及草坪草培育技术领域，具体地说，涉及一种草坪草种子组培外植体消毒的方法。

背景技术

草坪在城市园林绿化和国土绿化中占有重要的位置，对于平衡生态环境有很重要的意义。草坪不但可以美化环境，净化空气，调节小气候，降低噪音，保持水土和防止灾害等，而且还可以降低人的心理压力，消除疲劳，恢复体力。目前，为节约用水，降低草坪的养护费用，提高草坪的环境适应能力，培育耐寒、抗旱、耐盐碱、耐践踏等优良特性的草坪草新品种日益重要。随着生物技术的快速发展,特别是转基因在农业生产中的应用愈来愈成熟,为定向地培育草坪新品种提供了一条有效的途径。

而草坪草植株再生体系的建立是生物技术(转基因)育种的基础，本发明以高羊茅种子为外植体，进行愈伤组织诱导。诱导愈伤组织的前提是去除种子外的颖壳，当前通常采用的技术方案是采用手工剥除或用砂纸打磨的方法去掉草坪种子外的颖壳，但是由于草坪种子个体很小、在去除颖壳时，不但极其费工费时，并且组培材料经常因附带少量的颖壳(导致外植体消毒不彻底)或种皮受损导致草坪种子在诱导愈伤组织时，培养基极易受到杂菌的污染，经反复验证污染率达到30％左右，极大的影响实验工作的顺利开展。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种草坪草种子组培外植体消毒的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一种草坪草种子组培外植体消毒的方法，包括以下步骤：

A、选取需进行愈伤组织诱导的草坪草种子，将其加入浓硫酸中进行振荡处理，去除颖壳；

B、将去除颖壳的草坪草种子取出，置于水中，反复清洗残留的酸液；

C、将经B处理后的草坪草种子进行灭菌处理，然后清洗得无菌草坪草种子用于接种。

优选地，步骤A中，所述浓硫酸与草坪草种子的体积比为1:1-1.5。若浓硫酸体积过高、草坪草种子体积过低，将导致草坪草种子碳化作用过重，伤害草坪种子，同时造成硫酸的浪费；若浓硫酸体积过低、草坪草种子体积过高，则会导致草坪种子外的颖壳不能彻底碳化，会影响进一步的灭菌效果。

优选地，步骤A中，所述浓硫酸的质量浓度为1.6-1.84g/ml。若浓硫酸质量浓度过低，会导致草坪种子外的颖壳碳化不彻底，甚至失去对种子颖壳的碳化作用。

优选地，步骤A中，所述振荡时间为10-15秒，振荡幅度15-20mm，振荡频率为80-100/min。振荡幅度过大，振荡频率过高，极易导致浓硫酸飞溅出容器，产生危险；振荡幅度过低，时间过长，易导致种子接触浓硫酸不均匀，结果不但造成种子颖壳去除不均匀，还容易造成部分种子因硫酸碳化作用受损。

优选地，步骤B中，所述水的体积为浓硫酸体积的10-15倍。

优选地，步骤B中，所述反复清洗的次数为5-6次。

优选地，步骤C中，所述灭菌处理在超净工作台上进行；所述清洗采用高压灭菌处理过的无菌水。

优选地，步骤C中，所述灭菌处理具体步骤如下：先将草坪草种子用酒精处理1.5-2min、然后用HgCl₂处理8-10min。

优选地，所述酒精的质量浓度为70-75％；HgCl₂的质量浓度为0.1％。