[发明专利]一种快速检测鲤鱼浮肿病毒的引物及其方法

说明书

本发明公开了一种快速检测鲤鱼浮肿病毒的引物及其方法；旨在提供特一种异性强、灵敏性高、重复性好的快速检测鲤鱼浮肿病毒检测引物和方法；其技术方案包括引物核苷酸序列如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3所示的引物；检测方法为：1)从临床样本中提取病毒基因组DNA；2)以抽提的样本DNA为模板，使用权利要1所述的引物组，权利要求2探针配制RPA反应体系，采用TwistAmp exo试剂盒进RPA扩增反应；3)将RPA扩增后的反应管置于荧光检测仪中，实时监测荧光信号，如果有明显的荧光信号曲线，则说明样本中含有CEV，如无荧光信号曲线，则说明样本中不含有CEV；本发明属于动物的病原检测领域。

技术领域

本发明属于动物的病原检测领域，具体涉及快速检测鲤鱼浮肿病毒的引物及其方法。

背景技术

鲤鱼浮肿病(carp edema virus disease)是一种感染鲤和锦鲤的重要传染病，病原为鲤鱼浮肿病毒(carp edema virus CEV)，根据1997年Oyamatsu和Hata等人和2005年Miyazaki, Isshiki,和Katsuyuki等人提出其病原致病因子假定是痘病毒科的双链DNA病毒，临床上表现为嗜睡，皮肤出血伴下层组织水肿，眼球内陷和苍白肿胀的鳃，类似于锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus KHV)的临床症状。

鲤鱼浮肿病最早于1970年在日本发现，近几年CEV频发，在几个欧洲国家和印度、日本、中国、美国出现爆发性死亡现象。自2002年我国在广东发现该病以来，不断在国内多个养殖场发现，该疾病可能导致锦鲤和鲤鱼种群的高死亡率，发病范围广。因为在临床上难以区分锦鲤疱疹病毒，加上为了进一步防止感染和疾病的传播，需要一种可靠的检测方法。

目前，实验室检测方法主要是普通PCR、实时荧光PCR，然而这些操作复杂且不够快捷，还会产生昂贵的费用。因此，建立一种快速、有效的临床检测方法对临床诊断、监测、和流行病毒调查具有重要意义。

重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification RPA)是近年来发展起来的一种快速诊断不同病原的方法，已广泛用于病毒、细菌、寄生虫诊断研究。RPA利用重组酶蛋白与引物形成复合物；该复合物促进引物与双链DNA的同源靶序列的结合，ssDNA结合蛋白稳定非模板链的置换，并用链置换聚合酶进行启动互补DNA链合成。整个过程仅需在 37-42℃下反应20-40分钟即可。与普通PCR相比，整个过程不需要高温变性和低温退火，反应简单、快速高效。与荧光定量PCR相比，不需要昂贵的仪器。RPA引物比一般PCR引物长，通常需要达到30-35个碱基，扩增产物在300bp以内，目前基于RPA扩增产物进行检测的方法主要有三种形式：RPA与琼脂糖凝胶检测技术相结合(基础型RPA)、RPA与荧光检测技术相结合(real time RPA)、RPA与侧向流动免疫技术相结合(LFD-RPA)。目前国际上尚无采用realtime RPA检测CEV的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种特异性强、灵敏性高、重复性好的快速检测鲤鱼浮肿病毒检测用引物和探针。

本发明的另一目的在于提供快速检测鲤鱼浮肿病毒检测方法。

为此，本发明提供的第一个技术方案为：

一种快速检测鲤鱼浮肿病毒的引物，其核苷酸序列如下所示：

CEV-RPA-F：5`-GTATGGAATTAAGGCATACACTTATTCTCC-3`(SEQ ID NO：1)；

CEV-RPA-R：5`-TTGACGAGGGAATGATTGAGACAAAGTAGA-3`(SEQ ID NO：2)。

一种快速检测鲤鱼浮肿病毒的探针，其核苷酸序列如下所示：