[发明专利]一种苔藓植物外植体的消毒方法

说明书

本发明公开了一种杀菌效果好、消毒废液不污染环境且对人体无害、毒性小、不易损伤苔藓植物的苔藓植物外植体的消毒方法。该消毒方法通过对苔藓外植体清洗后，接着将外植体依次经过酒精、次氯酸钠、酒精、次氯酸钠浸泡消毒处理，然后利用无菌水清洗干净后放入培养皿中，培养14‑21天至培养基表面形成原丝体和茎叶体，剪取培养基表面形成的原丝体和茎叶体，并依次经过酒精、次氯酸钠、酒精、次氯酸钠浸泡消毒处理，最后再利用无菌水清洗干净后即可得到无菌的苔藓外植体，该消毒方法操作简单、所需外植体量少、操作门槛低、不使用高污染消毒剂、对环境无害，试验效果好。适合在植物组织培养技术领域推广应用。

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其是一种苔藓植物外植体的消毒方法。

背景技术

苔藓植物一般生长在较阴暗，较潮湿的土壤、林下、沼泽、岩石及树皮等阴面，通过配子体叶片等微孔吸收大气中的营养物质，同时由于苔藓一般为丛生，植株间紧密生长，因此外植体上附着大量微生物，且不易清除。并且由于苔藓植物外植体大多是单层细胞构成，细胞容易因为消毒过度而死亡，一些稀缺苔藓植物不容易获得孢蒴，苔藓生物量少，采集不易等，这些因素都极大地阻碍了苔藓组织培养的发展，以及对苔藓种质资源的保护和利用。外植体消毒是进行组织培养的第一步，现有的方法，多采用升汞进行消毒，浓度过高易造成外植体死亡，且容易残留，不易清洗消除，消毒效果不太理想，并且升汞是高毒性污染物，对人体伤害大，排出环境易造成土壤重金属残留。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种杀菌效果好、消毒废液不污染环境且对人体无害、毒性小、不易损伤苔藓植物的苔藓植物外植体的消毒方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：该苔藓植物外植体的消毒方法，包括以下步骤：

A、苔藓植物外植体的选取：挑选健壮的、生长旺盛的外植体，将外植体的假根部分切除后，放入流水中冲洗时间为3-8min；

B、将经过步骤A处理过后的外植体放入超声波震荡仪中清洗1-2h；

C、将经过步骤B处理过后的外植体浸泡在浓度为500mg/l的氨苄青霉素钠溶液中，并且在避光条件下恒温浸泡1-2h，所述氨苄青霉素钠溶液的温度为3.5-4.5度；

D、将经过步骤C处理过后的外植体依次经过如下浸泡处理：首先，放入浓度为75％酒精中浸泡一段时间后，利用无菌水清洗一段时间后接着放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡一段时间，利用无菌水清洗一段时间后再放入浓度为75％酒精中浸泡一段时间，利用无菌水清洗一段时间后再放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡一段时间，最后再利用无菌水清洗干净备用；

E、将经过步骤D处理过后的外植体放入培养皿中，培养皿底部装有无菌过滤棉，并在培养皿中加入营养液，加入的营养液量将培养皿底部放置的无菌过滤棉完全湿润即可，所述营养液由6-BA、氨苄青霉素钠、knop无机培养液组成，其中6-BA的浓度为0.1mg/L，氨苄青霉素钠的浓度为500mg/L；

F、将培养皿置于培养箱中培养14-21天至培养基表面形成原丝体和茎叶体，培养箱的温度为23-25度；每天24d中在黑暗中培养的时间为6-10小时，其余时间为光照下培养；

G、剪取培养基表面形成的原丝体和茎叶体，并依次经过如下浸泡处理：首先，放入浓度为75％酒精中浸泡一段时间，利用无菌水清洗一段时间后接着放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡一段时间，利用无菌水清洗一段时间后再放入浓度为75％酒精中浸泡一段时间，利用无菌水清洗一段时间后再放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡一段时间，最后再利用无菌水清洗干净后即可得到无菌的苔藓外植体。

进一步的是，在步骤A中，将外植体的假根部分切除后放入流水中冲洗时间为5min。

进一步的是，在步骤B中，将外植体放入超声波震荡仪中清洗2h，所述超声波震荡仪的超声波清洗频率为40kHz。