[发明专利]一种基于PD-1/PDL-1阻断功能及生物效应的抗癌药物快速筛选方法

权利要求书

1.一种基于PD-1/PDL-1阻断功能及其生物效应的药物快速筛选方法，包括以下步骤：

1)将红色荧光蛋白RFP接于PDL-1蛋白C端，构建PDL-1-RFP融合蛋白；

2)将抗CD3的抗体通过一个人工跨膜节段TLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAV偶联于MHCII蛋白下游，构建MHCII-antiCD3融合蛋白；

3)将绿色荧光蛋白基因d2EGFP构建在NFAT转录应答元件与TATA-LikePromoter的下游，将人源PD-1基因构建在高表达启动子CMV的下游，构建慢病毒载体pCMV_PD1.NFAT_d2EGFP；

4)将pCMV_PD1.NFAT_d2EGFP与质粒pH1、pH2共转染至慢病毒包装系细胞293V，收集CMV_PD1.NFAT_d2EGFP慢病毒并转染Jurkat，筛选构建高表达PD1的CMV_PD1.NFAT_d2EGFP/Jurkat稳转细胞系；

5)将抗PD-1或抗PDL-1的单抗药、小分子、或多肽阻断剂类新药与CMV_PD-1.NFAT_d2EGFP/Jurkat细胞共孵育后加入PDL-1-RFP融合蛋白和MHC-CD3抗体融合蛋白孵育；清洗去除非特异性结合后检测CMV_PD-1.NFAT_d2EGFP/Jurkat细胞表面的红色荧光蛋白RFP荧光值，判断抗PD1或抗PDL-1药的PD-1/PDL-1阻断功能；或处理细胞后检测分析CMV_PD-1.NFAT_d2EGFP/Jurkat细胞内的绿色荧光蛋白d2EGFP荧光值，判断该抗PD1药通过对PD-1/PDL-1的阻断作用对NFAT信号通路产生的生物学效应，是否提高T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。

2.如权利要求1所述的药物快速筛选方法，其特征在于步骤1)中，将红色荧光蛋白RFP基因与人全长PDL-1基因构建在同一个读码框使红色荧光蛋白RFP接于PDL-1蛋白C端形成PDL-1-RFP融合蛋白，在RFP的C端接上6个组氨酸His标签；编码带有组氨酸His标签的PDL-1-RFP融合蛋白的序列前后两端具有限制性内切酶酶切位点EcoRI和SexAI。

3.如权利要求2所述的药物快速筛选方法，其特征在于步骤1)中，编码带有组氨酸His标签的PDL-1-RFP融合蛋白序列插入慢病毒表达载体的CMV启动子下游，获得质粒pCMV-PDL1tagRFP；质粒pCMV-PDL1tagRFP上表达的靶标蛋白序列为PDL-1-tagRFP，编码PDL-1-tagRFP融合蛋白的DNA基因序列如SEQ ID NO：1所示，表达后PDL-1-tagRFP融合蛋白序列如SEQ ID NO：2所示。

4.如权利要求3所述的药物快速筛选方法，其特征在于步骤1)中，将pCMV-PDL1tagRFP与质粒pH1、pH2共转染至慢病毒包装系细胞293V，经5代或20天以上培养获得稳定表达目的蛋白细胞后，荧光显微镜下，用50μl的移液枪挑取高表达PDL-1-tagRFP融合蛋白的PDL1tagRFP/293细胞克隆；扩增收集PDL1tagRFP/293细胞，用匀浆、超声、或冷冻高压细胞破碎仪裂解细胞，1500g高速离心后取沉淀加His结合缓冲液，上Ni²⁺或Co²⁺His亲和法柱制备纯化重组PDL-1-tagRFP融合蛋白。

5.如权利要求1-4之一所述的药物快速筛选方法，其特征在于步骤2)中，将一个人工跨膜节段TLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAV的基因接于MHCII基因下游，再接上CD3的抗体基因序列；将MHCII-antiCD3基因通过EcoRI/NotI位点亚克隆至慢病毒表达载体pLV-Puro的CMV启动子下游，获得质粒pLV-MHCIIantiCD3；其中编码MHCII-antiCD3融合蛋白的DNA基因序列如SEQ ID NO：3所示；MHCII-antiCD3融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。