[发明专利]一种基于PD-1/PDL-1阻断功能及生物效应的抗癌药物快速筛选方法

说明书

本发明建立了一种基于PD‑1/PDL‑1阻断功能及其生物效应的药物快速筛选方法：将红色荧光蛋白RFP接于PDL‑1蛋白C端，构建PDL‑1‑RFP融合蛋白；将抗CD3的抗体通过一个人工跨膜节段偶联于MHC II蛋白下游，构建MHCII‑antiCD3融合蛋白；将人源PD‑1基因构建在高表达启动子CMV的下游，后续连接T细胞核因子转录应答元件与TATA‑Like Promoter以及绿色荧光蛋白基因d2EGFP，构建慢病毒载体，并建立高表达PD1的CMV_PD1.NFAT_d2EGFP/Jurkat稳转细胞系，以PDL‑1‑RFP与细胞系的亲和进行荧光检测筛选阻断剂。本方法可精确反映抗PD‑1或抗PDL‑1药物的PD‑1/PDL‑1阻断功能以及通过对PD‑1/PDL‑1的阻断作用对NFAT信号通路产生的生物学效应，判断其是否可以提高T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。

技术领域

本发明涉及一种抗PD-1和抗PDL-1药物的快速筛选方法，属于生物技术领域。

背景技术

肿瘤通过其细胞表面表达的细胞程序性死亡配体1(Programmed celldeath 1ligand1，PDL-1)与CD8+T细胞表面表达的细胞程序性死亡受体1(Programmed celldeathprotein1，PD-1)特异性结合，传导抑制性的信号，减低淋巴结CD8+T细胞的增生，从而使肿瘤细胞逃避免疫系统T细胞的杀伤作用。因而阻断PD-1/PDL-1的结合是肿瘤免疫治疗的重要方向之一。基于该靶点的PD-1/PDL-1阻断药物，如抗PD1、抗PDL-1单抗药、小分子、多肽阻断剂等成为目前抗癌药研发的热门。而基于PD-1/PDL-1阻断功能及生物效应的药物筛选方法是这类新药研发的核心技术之一。

本发明中下列表达式的意义为：

PD-1：Programmed celldeath protein 1，程序性死亡受体1

PDL-1：Programmed cel1 death 1ligand 1，程序性死亡配体1

MHC：Major histocompatibility complex，主要组织相容性复合体

CD3：Cluster of differentiation3，分化簇3

NFAT：Nuclear factor of activated T cells，活化T细胞核因子

Jurkat：人急性T淋巴细胞白血病细胞

TCR：T cell receptor，T细胞抗原受体

CMV：Cytomegalovirus，巨细胞病毒

RFP：Red fluorescent protein，红色荧光蛋白

d2EGFP：Destabilized enhanced green fluorescent protein不稳定增强型绿色荧光蛋白

发明内容

本发明的目的是建立了一种新型的基于PD-1/PDL-1阻断功能及生物效应的抗癌药物快速筛选方法。

本发明构思如下：

将红色荧光蛋白RFP接于PDL-1蛋白C端，构建PDL-1-tagRFP融合蛋白；将抗CD3的抗体通过一个人工跨膜节段TLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAV偶联于MHCII蛋白下游，构建MHCII-antiCD3融合蛋白。