[发明专利]一种基于CD47/SIRPα阻断功能及其生物效应的药物快速筛选方法

权利要求书

1.一种基于CD47/SIRPα阻断功能及其生物效应的药物快速筛选方法，包括以下步骤：

1)将第一荧光蛋白与CD47蛋白羧基末端连接构建重组CD47-第一荧光蛋白融合蛋白；

2)将第二荧光蛋白构建在SIRPα蛋白的下游；将第三荧光蛋白基因构建在PTPN11基因SH2结构域的下游；在CMV启动子下分别连接SIRPα-第二荧光蛋白和SH2_PTPN11-第三荧光蛋白基因片段，构建两个表达质粒；

3)将CMV-SIRPα-第二荧光蛋白和CMV-SH2_PTPN11-第三荧光蛋白的基因共转染到单核细胞系中，建立稳转细胞系；

4)稳转细胞系诱导成巨噬细胞，将巨噬细胞与抗SIRPα的单抗药、小分子、或多肽阻断剂孵育，清洗非特异性结合后与重组CD47-第一荧光蛋白融合蛋白共孵育；

或，将CD47-第一荧光蛋白与抗CD47的单抗药、小分子、或多肽阻断剂孵育，清洗非特异性结合后与巨噬细胞共孵育；

5)分别检测第一、第二、第三荧光蛋白荧光值，并判断单抗药、小分子、或多肽阻断剂对CD47/SIRPα信号通路的阻断功能；

其中第一荧光蛋白是RFP红色荧光蛋白；第二荧光蛋白是青色荧光蛋白CyPet；第三荧光蛋白是黄色荧光蛋白Ypet。

2.根据权利要求1的药物快速筛选方法，其中步骤1)中，将红色荧光蛋白tagRFP基因与人全长CD47基因构建在同一个读码框使tagRFP接于CD47蛋白C端形成CD47-tagRFP融合蛋白，同时在tagRFP的C端接上6个组氨酸His标签。

3.根据权利要求2的药物快速筛选方法，其中步骤1)中，将CD47-tagRFP基因通过EcoRI/SeXA I克隆到慢病毒表达载体pLV-puro的CMV启动子下，获得质粒pCMV-CD47tagRFP，去掉了原质粒中的PGK启动子和Puro抗性基因，有利于提高慢病毒的转染效率，而阳性克隆的筛选利用目标蛋白中tagRFP荧光蛋白直接用分选型流式细胞仪筛选或荧光显微镜下挑取；将pCMV-CD47tagRFP与慢病毒包装质粒pH1、pH2共转染到慢病毒包装系细胞293V，制备CMV-CD47tagRFP慢病毒，转染至人胚肾细胞293，筛选克隆获得高表达CD47-tagRFP融合蛋白的CD47-tagRFP/293细胞系；扩增该CD47-tagRFP/293细胞，裂解后用His亲和法制备纯化含重组CD47-tagRFP融合蛋白的膜碎片。