[发明专利]一种基于CD47/SIRPα阻断功能及其生物效应的药物快速筛选方法

说明书

本发明建立了一种基于CD47/SIRPα阻断功能及其生物效应的药物快速筛选方法：将红色荧光蛋白RFP偶联于CD47蛋白羧基未端(C端)；青色荧光蛋白基因CyPet构建在SIRPα蛋白的下游，以及黄色荧光蛋白基因Ypet通过一个连接肽(G4S)3构建在PTPN11基因的下游，分别构建真核表达载体，并获得新型的稳转细胞系SIRPαCyPet.SH2_PTPN11Ypet/THP‑1，以CD47‑RFP与细胞系的亲和进行荧光检测筛选阻断剂。本方法可精确反映抗SIRPα和抗CD47药的效应，可同时获得阻断功能与CD47/SIRPα信号通路的生物学效应数据，构建快速筛选抗CD47/SIRPα药物和评估其生物学效应的实验模型。

技术领域

本发明涉及一种基于CD47/SIRPα靶点的药物快速筛选方法，属于生物技术领域。

背景技术

CD47(Cluster of Differentiαtion 47，分化簇47)也被称为整合蛋白相关蛋白(IΑP)，是一种跨膜蛋白。CD47属于免疫球蛋白超家族，可结合配体血小板反应蛋白-1(TSP-1)和信号调节蛋白α(SIRPα，Signal Regulatory Proteinα，信号调节蛋白α)。SIRPα是一个调节性膜糖蛋白，主要表达于髓细胞、干细胞或神经元。SIRPα的胞内域包含4个ITIMs(Immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif，免疫受体基于酪氨酸的抑制域)，在SIRPα的胞外域结合CD47后传导信号至细胞内使ITIMs磷酸化，随即SHP磷酸酶，如PTPN11(PTPN11，SHP2：Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type11，酪氨酸蛋白磷酸酶非受体11型)被招募到细胞膜上并磷酸化激活酪氨酸激酶SHP2；同时SHP磷酸酶会抑制细胞表面肌凝蛋白的积累，并导致吞噬作用的抑制。肿瘤细胞表面高表达CD47。CD47作为一种不吃我信号通过CD47/SIRPα信号系统使肿瘤细胞避免被免疫系统的巨噬细胞吞噬，因而CD47/SIRPα是某些癌症的潜在治疗靶点。

基于CD47/SIRPα阻断功能的抗癌新药，包括抗CD47、抗SIRPα单抗药、小分子阻断剂、多肽阻断剂等的研发是目前医药领域热点之一。但目前为止尚未见有关基于CD47/SIRPα阻断功能及其生物效应的新药快速、高效而精准的筛选系统。

发明内容

本发明的目的是建立了一种基于CD47/SIRPα阻断功能及其生物学效应的药物快速筛选方法。

本发明构思如下：

采用红色荧光蛋白tagRFP偶联于CD47蛋白羧基末端；青色荧光蛋白基因CyPet构建在SIRPα蛋白的下游，黄色荧光蛋白基因Ypet通过一个连接肽(G4S)₃构建在PTPN11蛋白N端2个SH2结构域基因的下游，将两个带有荧光蛋白标记基因的片段构建载体并在细胞内表达，建立稳转细胞系。将稳转细胞系诱导成巨噬细胞后与抗SIRPα或抗CD47的单抗药、小分子、或多肽阻断剂共同孵育，清洗非特异性结合后与加入CD47-tagRFP融合蛋白共孵育。通过检测红色荧光蛋白tagRFP荧光值判断该抗SIRPα或抗CD47药具有CD47/SIRPα阻断功能；通过检测CyPet/Ypet荧光值并与对照组比较，判断抗SIRPα或抗CD47药具有CD47/SIRPα阻断功能。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种基于CD47/SIRPα阻断功能及其生物效应的药物快速筛选方法，包括以下步骤：

1)将第一荧光蛋白与CD47蛋白羧基末端连接构建重组CD47-第一荧光蛋白融合蛋白；

2)将第二荧光蛋白与构建在SIRPα蛋白的下游；将第三荧光蛋白基因构建在PTPN11蛋白N端2个SH2结构域基因的下游；在CMV启动子下分别连接SIRPα-第二荧光蛋白和SH2_PTPN11-第三荧光蛋白基因片段，构建表达质粒；