[发明专利]人血浆中游离甲氧基去甲肾上腺素与甲氧基肾上腺素的高效液相色谱串联质谱检测方法

权利要求书

1.人血浆中游离甲氧基去甲肾上腺素和甲氧基肾上腺素的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)样本预处理：取100～500μL人血浆，依次加入10～50μL内标工作液和0.1～1mL50mM pH＝8醋酸铵溶液，涡旋振荡30秒，4000rpm离心5分钟；

(2)取弱阳离子交换固相萃取96孔板，依次加入200μL甲醇与水淋洗，待其自然流干；

(3)固相萃取过程：将步骤(1)处理后的样品转移到步骤(2)处理后的SPE96孔板上，用氮气正压装置压干，依次加入50～500μL 50mM醋酸铵溶液(pH＝8)和50～500μL乙腈进行淋洗；再加入200μL 5％甲酸乙腈溶液洗脱，用96孔接收板收集洗脱液，通25～60℃氮气直至干燥；

(4)将步骤(3)得到的残渣，进一步用50～200μL复溶溶液复溶，涡旋使充分溶解，上高效液相色谱串联质谱系统进样5～50μL分析检测。

2.根据权利要求1所述的人血浆中游离甲氧基去甲肾上腺素和甲氧基肾上腺素的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中内标工作液的配置方法如下：精密称取2种内标标准品，用0.5％焦亚硫酸钠溶液溶解得到浓度为1mg/mL的氘代甲氧基去甲肾上腺素(NMN-d3)和氘代甲氧基肾上腺素(MN-d3)的内标储备液，然后用0.1％甲酸溶液进一步稀释混合得到含有NMN-d3浓度为10ng/ml和MN-d3的浓度为1ng/mL的内标工作液。

3.根据权利要求1所述的人血浆中游离甲氧基去甲肾上腺素和甲氧基肾上腺素的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述步骤(4)中的复溶溶液为甲酸和乙腈的混合物，其体积比为1:1000。

4.根据权利要求1所述的人血浆中游离甲氧基去甲肾上腺素和甲氧基肾上腺素的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述步骤(4)的高效液相色谱串联质谱为三重四级杆质谱仪。

5.根据权利要求1所述的人血浆中游离甲氧基去甲肾上腺素和甲氧基肾上腺素的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述步骤(4)通过高效液相色谱串联质谱法测定经预处理后的样品溶液，采用梯度洗脱正相色谱法建立待测物的分离条件如下：以水-乙腈-甲酸铵-甲酸为流动相体系，色谱柱为Silica柱，流速为0.4～1.0mL/min，柱温为30～45℃，采用多反应监测扫描模式(MRM)。

6.根据权利要求5所述的人血浆中游离甲氧基去甲肾上腺素和甲氧基肾上腺素的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱串联质谱法测定经预处理后的样品溶液使用的流动相由流动相A和流动相B组成；其中流动相A为体积分数0.1％甲酸-30mM甲酸铵溶液，流动相B为体积分数0.1％甲酸乙腈溶液，流动相A和流动相B的体积比为5～22％：95～78％。

7.根据权利要求5所述的人血浆中游离甲氧基去甲肾上腺素和甲氧基肾上腺素的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述色谱柱为Silica柱，其填料粒径为1.7～5μm，内径为2.1～4.6mm，柱长为25～150mm。

8.根据权利要求1或5所述的人血浆中游离甲氧基去甲肾上腺素和甲氧基肾上腺素的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述步骤(4)质谱检测采用电喷雾离子源(ESI)和MRM模式，用于检测的NMN与MN的母离子/子离子检测离子对如下所示：NMN，m/z166.1>m/z 134.1和m/z 166.1>m/z 121.1；MN，m/z 180.0>m/z 149.1和m/z 180.0>m/z120.9；内标NMN-d3的检测离子对为m/z 169.1>m/z 137.1；内标MN-d3的检测离子对为m/z183.1>m/z 151.1。