[发明专利]人血浆中游离甲氧基去甲肾上腺素与甲氧基肾上腺素的高效液相色谱串联质谱检测方法

说明书

本发明公开了一种血浆中游离甲氧基去甲肾上腺素与甲氧基肾上腺素的高效液相色谱串联质谱检测方法，包括如下步骤：(1)样品预处理，血浆样品依次加入内标工作液和醋酸铵溶液，涡旋混合，离心；(2)弱阳离子交换固相萃取96孔板(SPE96孔板)活化；(3)固相萃取处理，步骤(1)处理后样品上样至处理后的SPE 96孔板，甲酸乙腈溶液洗脱，洗脱液用氮气吹干；(4)复溶，高效液相色谱串联质谱法进行分析检测。本发明方法具有高准确度、高重现性、高灵敏度、高专属性、高效率、高通量、低成本、操作简便快速等优点。

技术领域

本发明涉及分析检测技术领域，特别涉及一种高准确度、高重现性、高灵敏度、高专属性、高效率、高通量、低成本、操作简便快速的人血浆中游离甲氧基去甲肾上腺素与甲氧基肾上腺素的高效液相色谱串联质谱检测方法。

背景技术

儿茶酚胺类物质即有邻苯二酚(即儿茶酚)结构的胺类化合物，包括多巴胺、去甲肾上腺素和肾上腺素及它们的衍生物。去甲肾上腺素和肾上腺素既是肾上腺髓质所分泌的激素，又是交感神经和中枢神经系统中去甲肾上腺素能纤维的神经介质。去甲肾上腺素在中枢神经系统内分布广泛，含量较多，而肾上腺素含量则较少。多巴胺主要集中在锥体外系部位，也是一种神经介质。以上儿茶酚胺类物质都是重要的典型肾上腺素受体激动剂。儿茶酚胺类物质在体内调节基本生理功能，传递生理信号，是正常生理过程中重要的信号介质，同时在病理过程中其含量也会出现明显的变化。因此它们可以用于临床辅助诊断高血压、甲亢、嗜铬细胞瘤和神经母细胞瘤等内分泌相关疾病，其代谢产物甲氧基肾上腺素(MN)以及甲氧基去甲肾上腺素(NMN)对诊断嗜铬细胞瘤和神经母细胞瘤有极高的敏感度与准确度，是内分泌科指南推荐的首选检测指标。

目前常用的测定人血浆中的儿茶酚胺代谢产物的方法主要有放射酶学法、毛细管电泳法、荧光法以及高效液相色谱法等等；主要存在以下几点问题和缺点：

1、放射酶学法试剂昂贵，不能满足临床大批量检测的需求；

2、毛细管电泳法前处理包括渗析和离心等操作，且需进行毛细管修饰，以防止儿茶酚胺类物质与毛细管壁发生作用，因此该方法繁琐耗时，检测难度和成本较高；

3、儿茶酚胺类化合物的荧光较弱，且生物样本中含量极低，因此荧光法需额外的衍生化处理来加强荧光信号，较繁琐耗时；

4、液相色谱法需要相对复杂的前处理过程，以分离生物样本中杂质成分、费时费力，且灵敏度较低、分析时间长，检测通量低，基质干扰严重，特异性差，自动化程度低。

与传统检测方法相比，高效液相串联质谱法具有高特异性和高灵敏度等优势，但是现有两个公开的儿茶酚胺类化合物的液相色谱串联质谱检测方法，其存在以下的缺陷不足：

1.国家知识产权局网站上公开的“用液相色谱串联质谱技术检测儿茶酚胺及代谢产物的方法”，其包括固相萃取处理和质谱正离子模式扫描可同时检测6种儿茶酚胺类物质，该方法具有以下缺陷：(1)未规定使用结构一致的稳定同位素标记物内标。参考液相质谱方法检测临床指导原则，内标应选择待测物结构一致的稳定同位素标记物，以校正质谱分析过程中基质效应以及样本提取、色谱分离和离子化过程产生的偏差，其他类型的化合物内标可能影响检测结果的准确性；(2)采用正离子扫描模式进行定量，而未使用指导原则规定的母离子和子离子筛选的多反应监测模式(MRM)。与MRM模式相比较，正离子扫描模式易受到生物样本的复杂基质的干扰，方法的特异性和专属性相对较差。

2.国家知识产权局网站上公开的“高通量液相色谱串联质谱的检测方法以及检测4种儿茶酚胺代谢物的方法”，方法包括S1样品制备、S2衍生化反应、S3样品前处理、S4液相色谱分离以及S5串联质谱检测等步骤，该方法具有以下缺陷：(1)前处理过程复杂，包括蛋白沉淀、真空冷冻干燥处理和衍生化反应等流程，繁琐耗时，仪器和试剂成本较高，不适合临床大批量样本分析；(2)对于NMN的检测，未使用结构一致的同位素标记物内标，可能影响实际临床样本检测的准确度和精密度；(3)样本的仪器分析时间较长，单个样本的分析需15min，效率较低，不适合临床大批量样本的检测。