[发明专利]磁珠-核酸适配体-多靶分子同时检测的方法及试剂盒

说明书

本发明属于分子生物学领域，基于靶分子配体和核酸配基的分子识别，结合磁分离纯化，通过质谱的分子定性定量分析，实现多分子组检测和多功能组信息的统一，能检测出机体或组织的分子组和功能组的相关性。本发明利用磁分离简单完成靶分子组的分离；利用适配体的特异性和高亲和性可有效获得靶分子组；质谱有效的进行多分子的定性定量，实现二次分子检测，提高检测的准确性；多分子的统一定性定量可较真实的反应分子间的相互关系，同时也揭示机体功能的相互关系，利于蛋白质组学和基因组学研究与临床分子检测。

技术领域

本发明涉及磁珠-核酸适配体-多靶分子同时检测的方法及试剂盒，尤其是涉及一种通过多分子样品的标志物核酸适配体组捕捉样品中的标志物分子利用激光解析飞行质谱对检测标志物进行定性定量，再利用数据平台的分析处理得到样品综合体系的检测分析结果，具体的说是涉及对样品整体特征分子检测和综合体系分析。

背景技术

早期蛋白质检测是以抗体同特定待检物蛋白质的低解离常数和一定的特异性为基础，抗体捕捉方法是简易方便的筛选方法。抗体捕捉法中，抗原包被于固相支持物，然后用抗体去结合抗原，洗板去掉未结合的抗体，最后用和结合抗体特异识别的标记分子去检测结合抗体，许多抗体捕捉法是利用间接法来检测抗体。例如，检测抗体是鼠抗体，检测分子可能是带检测标记的兔抗鼠抗体。传统的检测标记包括放射性同位素，染料和作用于底物产生可检测分子如色原的酶。

抗原捕捉检测法是检测样品中有无抗原。首先抗体先结合到支持物上，然后抗原加入和抗体反应形成复合物，最后检测复合物。也可以抗原抗体先反应形成复合物后，再结合到固相支持物上，然后检测复合物。

ELISA是广为人知的免疫检测法，1971年一问世，就启动了诊断方法的革命，传统的ELISA技术似三明治夹心法，即两抗体共同结合到某一抗原。捕捉抗体同样品中的抗原结合，再加入同抗原结合的偶联酶的检测抗体反应形成捕捉抗体—抗原—检测抗体“三明治”复合物，最后测偶联酶活性显示检测结果。

抗体检测法具有较大的应用价值，但是他的检测范围受捕捉抗体和抗原反应的Kd值限制，在实践中，检测底线大约是Kd值的1％，当待分析物浓度降低到这个可能检测限时，捕捉到待分析物抗体百分率不足以产生相对于信噪比的可检测信号。因此，用荧光或化学发光检测系的抗体检测法的检测下限约1pg/ml(10-4M对平均分子量50，000道尔顿的蛋白质)。

核酸与蛋白质在细胞内相互作用是普遍现象。核酸能折叠形成二级结构和三级结构，这对其与蛋白质相互结合作用非常重要。通过使核苷酸序列多样化而使体外检测核酸蛋白质相互作用方法成熟。SELEX技术被用来分离所选靶标的核苷酸配体，这些配体被称为配基或适配体，意即核酸可以形成一定结构并适配入靶分子的口袋，SELEX技术就是利用该原理筛选靶分子配基的方法。

Gold等在1995年(Gold L，et al.Annu Rev Biochem,64:763--797)应用SELEX筛选出的系统性红斑狼疮特异抗体的RNA和ssDNA配基，不仅对系统性红斑狼疮进行诊断，而且进行病情监测和疗效检验。Gold等又在1999年(Gold L，et al.Diagn Dec；4(4):381-8)在配基微阵分子诊断应用研究中,对配基微阵分辨率进行研究,均显出核酸配基检测有巨大的应用前景。但是目前的配基检测都是采用直接对配基PCR扩增放大检测的方法。这种方法操作复杂，需要将配体和配基分离，且灵敏度低(由于配体和配基分离后，配基纯度及残留配体和配基的再结合阻断DNA复制)和准确性差。

SELEX技术开始后，许多靶标的核苷酸配基已被筛选出，尤其是已知能和核酸结合的许多蛋白质可作为SELEX技术的较合适靶标，如T4DNA聚合酶、噬菌体R17被膜蛋白，大肠杆菌rho因子，大肠杆菌核糖体蛋白S1，苯丙氨酸-tRNA合成酶，识别RNA的自身免疫抗体，E2F转录因子，不同的HIV相关蛋白。