[发明专利]产生肝巨噬细胞的方法及其用途

说明书

本公开内容提供了通过使用包含肝细胞条件培养基和基础培养基的肝巨噬细胞培养基从干细胞衍生的单核细胞衍生肝巨噬细胞的方法，其中通过在细胞外基质存在下，在无血清细胞培养基中培养肝细胞获得所述条件培养基。还公开了用于这种方法的试剂盒和使用所述方法衍生的肝巨噬细胞及其用途。

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年1月5日提交的新加坡专利申请号10201700068V的优先权的权益，其内容为了所有目的通过引用整体并入本文。

发明领域

本发明涉及细胞生物学和生物化学，特别是衍生和维持肝巨噬细胞的方法。

背景技术

肝脏负责多种功能，最重要的功能是代谢、解毒和蛋白质合成。这些功能中的许多功能在肝细胞中进行，肝细胞是构成所有肝细胞的60％的实质细胞。然而，肝脏还含有大比例的非实质细胞，包括肝窦内皮细胞、肝星状细胞、胆管细胞和库普弗细胞(Kupffer cell，KC)。库普弗细胞是肝脏中的常驻巨噬细胞。它们位于肝窦中，是肝脏中最大的先天免疫细胞群，占所有肝细胞的约10-15％，代表体内超过80％的组织巨噬细胞。

由于其丰度和定位，库普弗细胞是肝内先天免疫系统的关键细胞成分。它们专门执行清道夫和吞噬功能，并在肝脏免疫方面和在肝脏炎症过程中调节异生物质代谢方面发挥重要作用。库普弗细胞构成身体的第一个巨噬细胞群，以充当病原体和病原体衍生产物(例如通过门静脉进入肝脏的脂多糖)的屏障。库普弗细胞在正常肝脏生理稳态和调节肝脏对毒性化合物的急性和慢性反应中起重要作用。库普弗细胞通过直接的细胞与细胞接触以及激活时释放多种炎性细胞因子和生长因子以及活性氧物质来发挥这种作用。已知这些分泌因子、尤其是白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子-a(TNFα)诱导急性期蛋白质的合成并抑制细胞色素P450(CYP)酶(涉及异生物质的解毒的主要代谢酶组)的活性。证明激活的库普弗细胞在调节肝细胞损伤中的作用的一个很好的实例是对乙酰氨基酚诱导的肝毒性。据报道，库普弗细胞有助于损伤以及防止肝细胞损伤，这表明库普弗细胞可能是初始保护性反应的主要位点，该反应在进一步刺激时发展为引起损伤。由于这些相互作用导致严重的药理学和毒理学后果，因此对开发可模拟肝脏基础和炎症状态的市售体外模型存在明显的未满足的需求。这样的系统对于研究药物代谢和发现、肝毒性和预测临床结果至关重要。

大多数报道的体外研究使用来自动物来源的库普弗细胞。由于种间变异性，研究来自人来源的库普弗细胞的功能和作用将是重要的。然而，由于供体可用性、成本和繁琐的分离程序，人库普弗细胞的来源受到限制。而且，原代人库普弗细胞(PHKC)不能在延长的时间段内维持或在培养中扩繁以获得更大的细胞数。因此，需要一种衍生类似于PHKC特征的肝巨噬细胞的方法。

发明内容

在第一方面，提供了从单核细胞衍生肝巨噬细胞的方法，其包括在肝巨噬细胞培养基中培养单核细胞，其中所述肝巨噬细胞培养基包含条件培养基和基础培养基，其中所述条件培养基通过以下方法获得，所述方法包括：(a)在细胞外基质存在下，在无血清细胞培养基中培养肝细胞1至7天；和(b)在(a)中的培养过程结束时分离上清液。

在第二方面，提供了从多能干细胞衍生肝巨噬细胞的方法，其包括：(a)培养多能干细胞以获得单核细胞；和(b)在肝巨噬细胞培养基中培养来自(a)的单核细胞，其中所述肝巨噬细胞培养基包含条件培养基和基础培养基，其中所述条件培养基通过以下方法获得，所述方法包括：(i)在细胞外基质存在下，在无血清细胞培养基中培养肝细胞1至7天；和(ii)在(i)中的培养过程结束时分离上清液。在一个实例中，(a)培养多能干细胞以获得单核细胞还包括：(i)培养多能干细胞以获得胚状体；和(ii)分化胚状体以获得单核细胞。在一个实例中，所述多能干细胞是经诱导的多能干细胞。在一个实例中，在第一方面和/或第二方面的方法中在肝巨噬细胞培养基中培养单核细胞包括在不存在细胞外基质的情况下在肝巨噬细胞培养基中培养单核细胞。