[发明专利]制备核酸文库的方法和用于实施所述方法的组合物和试剂盒在审

申请号：	201880006993.X	申请日：	2018-02-13
公开（公告）号：	CN110199022A	公开（公告）日：	2019-09-03
发明（设计）人：	马格诺利娅·博斯蒂克;伊施明德尔·曼恩;安德鲁·艾伦·法默;萨拉·泰勒	申请（专利权）人：	宝生物工程(美国)有限公司
主分类号：	C12N15/10	分类号：	C12N15/10;C07K14/705;C07K14/725;C40B50/06
代理公司：	北京柏杉松知识产权代理事务所(普通合伙) 11413	代理人：	王春伟;刘继富
地址：	美国加利***	国省代码：	美国;US
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摘要：
搜索关键词：	制备文库核酸文库试剂盒单细胞水平表达文库免疫细胞模板转换互补DNA 双股索引
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【说明书】：

提供了制备核酸文库的方法。所述方法的方面包括由通过涉及RNA样品的模板转换反应产生的双股互补DNA(cDNA)产生一个或多个文库，包括例如表达文库和/或免疫细胞受体谱系文库。在一些方面，所述方法包括由单细胞制备文库和/或制备在单细胞水平下索引的文库。还提供了用于进行所述方法的组合物和试剂盒。

相关申请的交叉引用

按照35 U.S.C.§119(e)，本申请要求2017年2月16日提交的美国临时专利申请序列号62/459,858的提交日期的优先权；所述申请的公开内容以引用的方式并入本文中。

背景技术

下一代测序(NGS)技术的发展已经允许从产生的核酸文库快速提取有价值的基因组和转录物组信息。例如Illumina(Solexa)测序、Roche 454测序、Ion torrent(质子/PGM测序)和SOLiD测序等高通量NGS技术允许比先前使用的桑格测序(Sanger sequencing)更迅速和廉价地对核酸分子测序，因而这些技术已经彻底改革生物技术和生物医学研究。

这些有效的测序技术尤其着重于文库制备。可以使用NGS技术分析充分制备的逆转录互补DNA(cDNA)文库，以达成一系列不同目的。举例来说，取决于文库制备方法，转录物组数据可以用于进行差异表达分析以鉴定在某些情况下上调或下调的基因。

cDNA文库还可以用于通过NGS进行T细胞受体(TCR)概况分析。TCR控制T细胞的选择、功能和活化，并确定T细胞对抗原肽-主要组织相容性复合物(MHC)中的哪些复合物反应。由于TCRα-链和β-链基因是从各细胞中可变区、多样性和连接(V(D)J)TCR基因区段的体细胞重组衍生的，所以个体的TCR谱系是非常不同的。对TCR的此多样性进行概况分析推动了对免疫谱系动力学的了解，促进对免疫反应的性质和免疫病症的病变的认识。这样的见解使多种疗法得到发展，包括迅速促进免疫肿瘤学领域。

发明内容

附图说明

图1提供了根据本公开的一实施方案由单一RNA样品制备两个核酸文库的方法的示意图。

图2提供了根据本公开的一实施方案由单一RNA样品制备表达文库和免疫细胞受体谱系文库的方法的示意图。

图3提供了使用模板转换反应产生产物双股核酸的示意图。

图4提供了在文库制备方法中使用标签化的一实例，其可能适用于本公开的方法中。

图5提供了展示根据本公开的一实施方案，用于产生用于组合的差异基因表达分析和TCR概况分析的文库的全过程的总示意图。

图6提供了显示如本文中提供的有关实例中所述，用于由单T细胞制备TCR概况分析文库的全过程的总示意图。

图7描绘了如与图6中所示的实例相关，96孔盘中索引寡核苷酸分布和样品的汇集。

图8提供了测试免疫细胞概况分析工作流程的性能的数据，其展示与由单Jurkat细胞或与单细胞同等量的Jurkat RNA产生的TCR-α或TCR-β CDR3区域对应的测序读数的百分比。

图9提供了测试免疫细胞概况分析工作流程的性能的进一步数据，其展示与预期Jurkat克隆型对应的测序读数的百分比。

图10提供了以多样品纳米分配器(MSND)格式测试的单细胞TCR概况分析工作流程的总示意图。