[发明专利]用于长程测序的条形码化DNA

说明书

本发明涉及用于促进核酸序列组装的方法和试剂盒，所述方法包括产生条形码，所述条形码编码从中合成多个完整或部分互补拷贝并随后测序的模板核酸的身份。

背景技术

本发明涉及DNA测序领域，且尤其涉及促进序列组装和定相测序的方法。

发明概述

本发明提供了促进核酸序列组装的方法，该方法包括：a）提供包含单链模板核酸的核酸样品；b）用一条或多条条形码起始引物引发各模板核酸以产生退火的核酸组装体，其中每条条形码起始引物包含3'-模板杂交部分和5'-条形码起始部分；c）进行聚合酶延伸以产生互补链，所述互补链保持与模板核酸退火；d）进行两轮或多轮偶联寡核苷酸编码单元“可测定的聚合物亚单元”（APS）的分开-合并合成，以在包含条形码区、引物区和与所述靶核酸互补的靶特异性区域的互补链的每一条上组装寡核苷酸条形码序列；e）对条形码化互补链进行测序；和f）使用条形码序列，鉴定由相同模板核酸产生的条形码化互补链，并从条形码化互补链的靶特异性区域组装模板核酸序列。

在一些实施方案中，该方法还包括在步骤（b）之前用亲和标签在3'末端对单链模板核酸进行末端标记。在一些实施方案中，亲和标签用于在进行步骤（e）之前纯化步骤（e）的条形码化的链。在一些实施方案中，亲和标签是生物素。在一些实施方案中，核酸是DNA。在一些实施方案中，DNA是基因组DNA或外来DNA。在一些实施方案中，条形码起始引物分子的第一序列区包含随机引物序列区。在一些实施方案中，随机引物序列区的长度为约4个核苷酸至约10个核苷酸。在一些实施方案中，条形码起始引物分子的第一序列区包含半随机引物序列区。在一些实施方案中，半随机引物序列区的长度为约4个核苷酸至约10个核苷酸。在一些实施方案中，条形码起始引物分子还包含扩增引物结合序列、测序引物结合序列或两者。在一些实施方案中，条形码起始引物平均每50-1,000个碱基对与模板核酸结合。在一些实施方案中，聚合酶延伸反应还包括使用双脱氧核苷酸以引入合成终止，从而防止聚合酶分子从退火的核酸组装体中的置换(displacement)或将其降到最低。在一些实施方案中，APS选自2至200种独特APS的库。在一些实施方案中，APS是寡核苷酸。在一些实施方案中，APS还包含错误检查子代码。在一些实施方案中，每个APS还包含随机或半随机标签序列。在一些实施方案中，随机或半随机标签序列的长度为2至8个核苷酸。在一些实施方案中，与模板核酸片段的每个单独条形码化的互补核酸拷贝缔合的随机或半随机标签序列充当独特的分子计数器序列。在一些实施方案中，与模板核酸条形码序列缔合的不同分子计数器序列的数目用于计算衍生自给定模板DNA核酸的互补DNA拷贝的初始数目，或用于检测给定模板DNA核酸内的重复序列。在一些实施方案中，分子计数器序列用于确定模板核酸序列变体在扩增反应期间衍生自聚合酶错误的概率。在一些实施方案中，通过退火至夹板分子在两轮或多轮分开-合并合成期间组装APS。在一些实施方案中，使用连接或点击化学在两轮或多轮分开-合并合成期间组装APS。在一些实施方案中，该方法用于长程DNA序列组装。在一些实施方案中，该方法用于序列定相。在一些实施方案中，该方法用于单倍型分析。在一些实施方案中，该方法用于确定选自缺失、插入、重复、易位和倒位的基因组DNA结构变异。

还公开了系统，其中该系统被配置以进行如所附权利要求中描述的方法。

本发明进一步提供了试剂盒，其包含由以下组成的组分：一组条形码起始引物、一种或多种聚合酶、核苷酸、双脱氧核苷酸、一组可测定的聚合物亚单元（APS）、模板分子（夹板）、连接试剂、点击化学偶联试剂、扩增引物和测序引物。

在一些实施方案中，条形码起始引物包含随机引物序列区。在一些实施方案中，条形码起始引物包含半随机引物序列区。在一些实施方案中，APS的组包含2至20种独特APS。在一些实施方案中，APS是寡核苷酸。

附图简述

在所附权利要求中具体阐述了本发明的新颖特征。通过参考以下详述将获得对本发明的特征和优点的更好理解，所述详述阐述了其中利用本发明的原理的示例性实施方案以及附图，在所述附图中：