[发明专利]单体人IgG1 Fc和双特异性抗体

说明书

本发明涉及单体Fc(mFc)多肽和制备和使用这样的多肽的方法。多肽包含IgG1 Fc结构域，在CH3疏水界面中有一个或两个残基(T366和Y407)的突变。本发明还讨论了制备包含mFc的双特异性抗体及其变体的方法。

背景技术

抗体在防御入侵的非自身分子方面起重要作用。抗体通过Fc(可结晶片段)区域以pH依赖性方式与新生儿Fc受体(FcRn)相互作用的能力赋予它们延长的血清半衰期(Ghetie和Ward 2000)。抗体的这种独特特征允许通过工程化Fc融合分子来延长血清中治疗性蛋白质或肽的半衰期。天然存在的IgG抗体和工程化Fc融合分子是二价和单特异性的。这是由于抗体Fc的同源二聚体性质。对于某些治疗应用，期望保留抗体或抗体的Fc片段赋予的所有积极属性，同时通过工程化单体Fc(mFc)多肽实现灵活性和特异性。

人血清中最丰富的免疫球蛋白类是IgG。IgG结构具有四条链：两条轻链和两条重链；每条轻链具有两个结构域，每条重链具有四个结构域。抗原结合位点位于ab区(抗原结合片段)，其含有可变轻链(VL)和可变重链(VH)结构域以及恒定轻链(CL)和恒定重链(CH1)结构域。抗体的Fc(可结晶片段)区域含有重链的CH2和CH3结构域区域(图1)。IgG分子可以被认为是具有通过铰链区的二硫键(-S-S-)保持在一起的两条重链和两条轻链的异四聚体。IgG的FcRn(新生儿Fc受体)结合位点位于抗体的Fc区(Martin，West等，2001)，因此抗体的延长的血清半衰期特性保留在Fc片段中。单独的Fc片段可以被认为是包含CH2和CH3结构域的重链的同源二聚体。具有完整抗体一半大小的单价抗体仅包含一条轻链和一条重链，在重链Fc区中具有一些突变以使抗体在水溶液/血清中稳定。已经成功开发了在Fc区中具有三个或更多个突变的单价IgG用于靶向癌症生物标志物(Merchant，Ma等，2013)。与具有三个或更多个突变的Fc相比，在Fc区中仅具有两个突变的单价IgG可以导致在人中没有或更低免疫原性。

随着遗传和蛋白质工程技术的最新进展，出现了双特异性抗体(BsAb)，例如BiTE、Xmab和CrossMab双特异性技术，以显示出有希望的应用(Nagorsen，Bargou等，2009)(Schaefer，Regula等，2011)。两种BsAb被批准用于治疗，超过30种正在进行临床开发。BiTE是一种具有通过(G4S)3多肽接头连接的两个单链抗体可变片段(scFv)的融合蛋白。在不存在Fc的情况下，它们不可以用蛋白质A和G纯化，并且具有短的体内半衰期，因此，在临床使用中需要连续输注。Roche CrossMab含有Fc，因此体内半衰期比BiTE长得多。CrossMab使用用于Fc异二聚化的杵臼技术，但不可以产生100％异二聚化抗体。Xmab双特异性技术在CH3结构域使用CH1/CL相互作用和静电相互作用的组合以分别在两个Fc多肽的N端和C端形成两个抗原结合位点。但是由于Xmab在N端和C端的两个结合位点的长距离，不容易形成类似于在天然细胞毒性T细胞识别过程中形成的免疫突触。因此，迫切需要制备新型抗体，例如工程化双特异性抗体，以改善癌症或其他疾病的治疗。

发明内容

本发明提供一种单体Fc(mFc)多肽，其包含CH2和CH3结构域，其中所述CH3结构域包含一个或两个氨基酸置换。本发明提供一种mFc多肽，其包含CH2和CH3结构域，其中所述CH3结构域由具有一个或两个氨基酸置换的CH3及其变体组成。本发明中的置换显著降低多肽形成同源二聚体的能力。在一个实施方式中，二聚化的降低为40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在另一个实施方式中，单体Fc多肽是非天然存在的多肽。本发明还提供包含mFc多肽的双特异性抗体的各种构型。