[发明专利]单链结合蛋白

说明书

本发明涉及单链DNA结合蛋白(SSB)去杂交DNA分子或防止互补ssDNA杂交的用途，所述SSB在500mM钠离子存在下表现出其最大ssDNA结合能力的至少50％，其中SSB包含：SEQ ID NO：1的氨基酸序列或与SEQ ID NO：1至少75％相同的氨基酸序列，或其功能片段，并且其中DNA分子存在于或暴露于含有以下中一种或多种的溶液中：(i)至少350mM的钠离子，(ii)至少50mM的钾离子，(iii)至少150mM的镁离子，或(iv)至少200mM的钙离子。

技术领域

本发明涉及单链(也称为单链的)DNA结合蛋白(SSB)，特别是涉及能够在高盐浓度下起作用的一类SSB。

背景技术

单链DNA结合蛋白(SSB)能够结合单链DNA(ssDNA)和RNA，形成核蛋白复合物，而它们对双链DNA的亲和力低。然后，存在于这种复合物中的核酸可以作为聚合酶或其它DNA或RNA修饰酶的底物。最佳表征的SSB来自大肠杆菌(E.coli，178个氨基酸的蛋白质)，其结合ssDNA作为同源四聚体。

SSB参与体内DNA复制和重组，有效地保持解链DNA双链体的分离(防止再退火)并使两条链保持单链形式。SSB可用于需要以单链形式保存DNA或RNA的所有应用。聚合酶链反应(PCR)技术可以通过添加SSB来优化，SSB可以稳定变性DNA，防止双链体形成并保护ssDNA免受核酸酶的消化。SSB还用于逆转录PCR和核酸的等温扩增。其它应用包括在定点诱变中与RecA组合使用。SSB刺激用于DNA测序反应的特定DNA聚合酶，并且在焦磷酸测序技术的背景下，它增加信号强度，减少非特异性信号并提高聚合效率。

SSB在分子生物学中的应用是清楚的，然而，SSB的熟练程度在很大程度上取决于反应混合物中存在的盐的类型和浓度(Nucleic Acid Research[2008]Vol.36No.1p294-9)。特别是，没有商业上可获得的SSB能够在升高的盐浓度下形成稳定的核蛋白复合物。盐稳定的核蛋白复合物能够经受高盐缓冲液的洗涤，这是非常需要的，例如在“下一代”DNA测序中，例如Illumina工作流程方法。已经发现需要可以在广泛的盐条件下形成稳定的核蛋白复合物的SSB，特别是在升高的盐浓度下，以及可以在高盐浓度存在下进行的核酸扩增和测序方法。

发明内容

本发明人已经开发了采用适当相容的SSB分子的这些方法。

在第一方面，本发明提供了一种核酸扩增或测序的方法，其中反应混合物或样品溶液含有单链DNA结合蛋白(SSB)，该SSB在500mM钠离子存在下表现出其最大ssDNA结合能力的至少50％。

在另一方面，本发明提供了一种定点诱变的方法，其中反应混合物含有单链DNA结合蛋白(SSB)，该SSB在500mM钠离子存在下表现出其最大ssDNA结合能力的至少50％。

在另一方面，本发明提供了一种使用显微镜检查(例如细胞内)核酸结构的方法，其中核酸样品与单链DNA结合蛋白(SSB)接触，该SSB在500mM钠离子存在下表现出其最大ssDNA结合能力的至少50％。在这些方法中，SSB稳定和/或标记ssDNA的区域。

在这些方法中，例如，可以使用电子显微镜或荧光显微镜。在荧光显微术方法中使用的SSB可以是荧光衍生物，例如加入荧光标签。

在另一方面，本发明提供了一种限制酶消化的方法，其中反应混合物含有单链DNA结合蛋白(SSB)，该SSB在500mM钠离子存在下表现出其最大ssDNA结合能力的至少50％。

在另一方面，本发明提供了一种逆转录的方法(例如作为RT PCR方法的第一步)，其中反应混合物含有单链DNA结合蛋白(SSB)，该SSB在500mM钠离子存在下表现出其最大ssDNA结合能力的至少50％。