[发明专利]用于去除不需要的核酸的方法和试剂盒

说明书

本申请提供了用于去除对应于样品中存在的不需要的RNA种类的扩增子的方法和试剂盒。所公开的方法和试剂盒使用与不需要的RNA的至少一部分退火的阻断剂，得到不是用于将接头连接到不需要的RNA末端的合适底物的双链体。

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年2月27日提交的美国临时申请序列号62/464321的权益，该临时申请以引用的形式全文纳入本文中。

关于联邦政府资助研究的声明

这项工作部分地在国家科学基金会资助号1431020的政府支持下进行。政府可对所要求保护的发明享有一定权利。

技术领域

本教导通常涉及核酸测序领域，特别涉及测序由小RNA分子产生的DNA文库和存在于这些文库中的扩增种类。更具体地，本教导涉及去除(deplete)最初存在于样品中的某些不需要的RNA种类(RNA species)，使得这些种类的相应扩增产物在由样品产生的测序文库中代表性不足(under-represented)或缺乏。

背景技术

使用下一代测序技术的小RNA测序(sRNA-seq)是用于在诸如癌症、干细胞生物学和表观遗传基因调控的领域中进行小RNA序型分析(profiling)和发现的常用工具。制备用于sRNA-seq的样品需要构建测序文库(sRNA文库)。当试图分析低频序列时，由于基因表达水平的宽动态范围而出现困难，所述基因表达水平的宽动态范围在一个样品中可以变化五个数量级或更多。因此，sRNA文库中主要是丰富的(abundant)RNA种类，因而需要更大的测序深度以获得样品中存在的不够大量的小RNA的足够信息。

目前用于减少丰富的RNA的方法昂贵、不精确，增加重要的额外步骤，和/或不适于整合到当前的sRNA-seq方案中。从测序文库中去除不需要的RNA分子的一种方法是基于使互补的DNA或RNA寡核苷酸探针与不需要的RNA杂交，然后通常利用探针上的标签或标记物(如生物素部分)去除探针-不需要的RNA的杂交体。去除丰富的RNA分子的另一种方法通过杂交不能延伸的“终止子”引物来防止丰富的RNA的逆转录。另一种方法使用双链DNA核酸酶(DSN)以通过使dsDNA文库分子变性并允许它们重新杂交来去除代表丰富的RNA的cDNA。丰富的cDNA将比不够丰富的cDNA更快地重新杂交，因此更有可能被DSN降解，从最终的测序文库中去除高丰度的cDNA。

至少出于上述原因，需要用于去除对应于来自sRNA-seq文库的一种或多种不需要的RNA种类的扩增产物的方法和试剂盒，其廉价，不增加重要的额外步骤，和/或可以整合到现有的测序文库制备和其他核酸扩增方案中。

发明内容

本教导公开了用于去除对应于样品中存在的至少一种不需要的RNA种类的扩增产物的数量的方法。这些方法在制备sRNA-seq文库中特别有用。还提供了适于实施某些公开方法的试剂盒。

用于去除至少一种不需要的RNA种类的某些方法实施方案包括将样品与至少一种阻断剂、至少一种3'接头和至少一种第一连接酶组合以形成第一反应组合物。将第一反应组合物在适于形成第一连接产物的条件下孵育。在各种实施方案中，在加入3'接头之前、与加入3'接头同时或在加入3'接头之后加入阻断剂。在各种实施方案中，在第一连接产物形成之前、与第一连接产物形成同时或在第一连接产物形成之后，将组合物在适于阻断剂与不需要的RNA退火的条件下孵育。

将包含第一连接产物的第一反应组合物与至少一种5'接头和至少一种第二连接酶组合以形成第二反应组合物，其在适于形成第二连接产物的条件下孵育。将包含第二连接产物的第二反应组合物与合适的酶组合，并扩增第二连接产物以产生扩增产物库(pool)。当与样品中存在的不需要的相对浓度的RNA相比时，对应于至少一种不需要的RNA种类的库中的相对浓度的扩增子被去除。在某些实施方案中，扩增产物库包含sRNA-seq文库。