[发明专利]具有降低的触角岩藻糖基化的重组糖蛋白

说明书

本发明涉及通过过表达α‑2,6‑唾液酸转移酶1(ST6Gal1)和/或α‑2,3‑唾液酸转移酶4(ST3Gal4)和糖蛋白来降低重组表达糖蛋白中复杂型N‑聚糖的触角岩藻糖基化的方法。还公开了能够用于所述方法的细胞系、各自的重组糖蛋白，以及在所述细胞系中表达所述重组糖蛋白的方法。

本发明涉及降低重组表达糖蛋白中复杂型N-聚糖的触角岩藻糖基化的方法、能够用于所述方法的细胞系、各自的重组糖蛋白以及在所述细胞系中表达所述重组糖蛋白的方法。

目前大多数重组治疗蛋白为糖蛋白。糖蛋白具有与天冬酰胺的氨基连接的糖残基(N连接聚糖)，或与丝氨酸或苏氨酸的羟基连接的糖残基(O连接聚糖)。多糖的结构是高度可变的，这取决于用于重组表达的特定蛋白和宿主细胞。

所谓的复杂型N-聚糖是在哺乳动物表达平台表达的糖蛋白上发现的非常常见的N-聚糖结构，其特征是核心糖序列Manα1-6(Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-AsN-。这种核心结构由N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)引发的“触角”延伸。通常，复杂型N-聚糖具有两个、三个或四个触角，但是在少数情况下能够有五个或六个触角。二个触角复杂型N-聚糖的通常结构如图1中的A所示。

复杂型N-聚糖能够岩藻糖基化。在哺乳动物细胞中，岩藻糖通过α1-6键与近端GlcNAc连接(核心岩藻糖)，或者通过α1-3键在一个或多个触角上与末端GlcNAc连接(触角岩藻糖；也称为路易斯抗原(Lewis^x antigen,Le^x)、CD15或SSEA-1)，如图1中的B所示。如果路易斯结构(Gal(β-4)[Fuc(α)]GlcNAc-R)含有另外的唾液酸，所得结构称为唾液酸-Lewis^x、唾液酸-Le^x或SLe^x(NeuAc(α1->4)Gal(β-4)[Fuc(α1->3)]GlcNAc-R)，如图1中的C所示。唾液酸-Lewis^x结构是由不同岩藻糖基转移酶催化的末端GlcNAc处的唾液酸化复杂型N-聚糖的岩藻糖基化形成的。核心α1-6岩藻糖基化在抗体中的作用已被广泛研究。IgG类抗体通常在Fc区的CH2结构域携带N-聚糖。存在于这些N-聚糖上的核心岩藻糖显著降低了体内抗体介导的ADCC(抗体依赖性细胞毒性)反应。由于ADCC通常是治疗性抗体的非常期待的效果，因此采取了若干方法来减少核心岩藻糖在IgG上的存在。高免疫原性核心α1-3连接的岩藻糖结构只存在于植物和无脊椎动物中，而不存在于人细胞中。

免疫球蛋白上通常没有触角岩藻糖，但是在其它血清糖蛋白上很容易检测到Lewis^x或唾液酸-Lewis^x结构。迄今为止，对其生理作用知之甚少。有证据表明触角岩藻糖可能通过选择素相互作用来增加对炎症部位的靶向性，但除此之外，对触角岩藻糖化的生理作用知之甚少。

当重组表达血浆蛋白时，与血浆中天然存在的对应物相比，该产物通常显示升高水平的触角岩藻糖。为了降低替代疗法中使用的重组蛋白的潜在免疫原性效应，期望重组蛋白尽可能与内源性蛋白相似。重组治疗性蛋白上触角岩藻糖的减少是实现该目标的重要步骤。

因此，本发明的技术问题是提供降低重组表达糖蛋白中复杂型N-聚糖的触角岩藻糖基化(Le^x或SLe^x)的方法，以及各自的重组糖蛋白及生产所述重组蛋白的方法。

上述技术问题的技术方案通过权利要求中表征的实施方案来实现。

具体而言，第一方面，本发明涉及降低重组表达糖蛋白中复杂型N-聚糖Le^x或唾液酸-Le^x的触角岩藻糖基化的方法，包括β-半乳糖苷β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸转移酶1(ST6Gal1)和/或α-2,3-唾液酸转移酶4(ST3Gal4)与糖蛋白一起过表达的步骤。