[发明专利]通过管内杂交与通用标签-微阵列的组合的突变的基因分型

说明书

目标基因片段的测定方法，其包括：扩增至少一种包含或可能包含至少一种目标SNP区域的目标基因片段，以形成初始扩增产物；从初始扩增产物形成至少一种单链扩增产物，其中所述单链扩增产物包含或可能包含至少一种目标SNP区域；在溶液中将所述单链扩增产物与至少一种报道分子杂交，所述报道分子包含寡核苷酸的至少两个不同的结构域，其中寡核苷酸的第一结构域用于与单链扩增产物杂交，并且其中寡核苷酸的第二结构域用于与至少一种微阵列探针表面杂交，其中微阵列探针表面包含至少一种捕获探针以允许杂交；将杂交单链扩增产物的溶液与至少一种微阵列探针表面接触，所述微阵列探针表面包含至少一种捕获探针以允许杂交；检测微阵列表面上杂交单链扩增产物的存在。在与癌症基因分型相关的优选实施方案中，KRAS癌基因的出人意料的良好结果表明所研究的所有7种密码子12和13突变可在小于90分钟内在组织临床样品中明确检测到。此外，该系统可以揭示代表少于0.1％起始材料的突变等位基因。通过将突变检测与阵列杂交解偶联，该技术变得通用。

背景

鉴定可导致疾病的DNA变体是人类遗传学的核心目标。具体而言，检测与恶性疾病相关的突变的能力有助于早期诊断、预防和治疗^1,2。癌症活检样品中的低频单核苷酸突变检测具有挑战性，因为它需要区分两个高度相似的序列，其中之一（野生型序列）显著地比另一个更丰富³。

液体活检是用于描述一类新兴的血液测试的术语，所述血液测试意在替代组织活检，以获得有关癌症的诊断、预后和治疗诊断信息。液体活检可以让医生获得患者特异性癌症的系统观点以及随时间监测它们的能力。使用血液、尿液、唾液，脑脊液、胸腔积液而不是组织，可以通过分析循环肿瘤DNA（ctDNA）来检测致癌的基因组改变。检测液体活检样品中的低频单核苷酸突变甚至比组织活检中更具挑战性，因为ctDNA占血液中总循环游离DNA的不到1％。因此，标准测序技术，诸如Sanger测序或焦磷酸测序，只能在肿瘤负荷较重的患者中检测ctDNA。数字聚合酶链反应的引入已使得能够以相当一致的方式检测ctDNA。

具体而言，液滴数字PCR（ddPCR）是新开发的方法之一，其允许在DNA（野生型和突变体DNA）的复杂混合物中计数稀有突变体变体。基于水-乳液液滴技术，ddPCR将DNA样品分级为例如20,000个液滴。随后在每个单独的液滴中发生模板的突变特异性扩增，并且计数阳性液滴给出精确的、绝对靶定量，作为每毫升血浆的拷贝数。据报道，ddPCR可以高灵敏度（0.01-0.001％）检测突变等位基因。但是，该方法缺乏多路复用能力。

另一种复杂且昂贵的基于ctDNA的癌症测试是靶向扩增子测序。最近，已经提出该技术有利于从基础研究到临床实践的转化。实际上，在特定条件下的下一代测序（NGS）可以达到分析ctDNA所需的高灵敏度，但是它昂贵且耗时。此外，它允许仅并行处理有限数量的样品并要求血浆样品特异性的生物信息学技能或已经开发的生物信息学工具。

近年来，已经进行了许多额外的努力来开发用于检测低丰度突变的其他高度特异性和敏感性技术，包括实时PCR、在较低变性温度下的共扩增-PCR（COLD-PCR）、焦磷酸测序、数字PCR^3,4和NGS。这些方法中的每一种都有优点和缺点。在这种情况下，本工作中提出的基于微阵列的方法代表了用于高通量检测单核苷酸突变的通用工具^5-7。

在消化器官和肺癌中，经常检测到KRAS癌基因的各种活化点突变。在肿瘤发生中，它们被认为改变GTP酶活性，导致不受调节的细胞增殖和恶性转化^8-10。最常见的突变聚集在位于外显子2中密码子12和13¹¹的非常狭窄的区域中。这些位点被认为是致癌过程中的突变热点。尽管突变的KRAS是目前唯一具有美国FDA批准的转移性结肠直肠癌（mCRC）伴随诊断测试的生物标志物¹²，但许多新兴的生物标志物（NRAS、BRAF和PIK3CA）可能证实为在临床上有用。