[发明专利]用于产生双功能蛋白质及其衍生物的方法

权利要求书

1.用于从用含有编码双功能蛋白质或其衍生物的cDNA的表达载体转化的哺乳动物宿主细胞产生重组双功能蛋白质的方法，所述方法包括在补充有硫酸葡聚糖的培养基中培养所述哺乳动物宿主细胞，其中所述双功能蛋白质包含：成纤维细胞生长因子21(FGF21)突变蛋白；生物活性蛋白或其突变体或片段；以及免疫球蛋白Fc区，其中所述FGF21突变蛋白包含选自以下突变(1)至(7)中的至少一种突变：

(1)从野生型FGF21蛋白的N端起第98至101位的氨基酸替换为氨基酸序列EIRP(SEQ IDNO：53)；

(2)从野生型FGF21蛋白的N端起第170至174位的氨基酸替换为氨基酸序列TGLEAV(SEQID NO：54)；

(3)从野生型FGF21蛋白的N端起第170至174位的氨基酸替换为氨基酸序列TGLEAN(SEQID NO：55)；

(4)从野生型FGF21蛋白的N端起第170位的氨基酸替换为氨基酸N；

(5)从野生型FGF21蛋白的N端起第174位的氨基酸替换为氨基酸N；

(6)从野生型FGF21蛋白的N端起第180位的氨基酸替换为氨基酸E，连同上述突变(1)至(5)中的一种或更多种；以及

(7)用于降低野生型FGF21货白之免疫原性的1至10个氨基酸的突变。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物活性蛋白是选自以下的生物活性货白：胰岛素、C-肽、瘦素、胰高血糖素、胃泌素、胃抑多肽(GIP)、胰淀素、降钙素、胆囊收缩素、肽YY、神经肽Y、骨形态发生蛋白-6(BMP-6)、骨形态发生蛋白-9(BMP-9)、胃泌酸调节素、催产素、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰高血糖素样肽-2(GLP-2)、鸢尾素、含III型纤连蛋白结构域蛋白5(FNDC5)、爱帕琳肽、脂连蛋白、C1q和肿瘤坏死因子相关蛋白(CTRP家族)、抵抗素、内脏脂肪素、网膜素、视黄醇结合蛋白-4(RBP-4)、肠高血糖素、血管生成素、白介素-22(IL-22)、毒蜥外泌肽-4和生长激素。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述双功能蛋白质包含从N端至C端依次连接的所述生物活性蛋白、所述免疫球蛋白Fc区和所述FGF21突变蛋白。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述硫酸葡聚糖的重均分子量为20至5,000kDa。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述培养基含有浓度为0.01至10g/L的所述硫酸葡聚糖。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述培养包括：

在34至37℃下将所述哺乳动物宿主细胞在补充有硫酸葡聚糖的培养基中进行原代培养的步骤；以及

在28至33℃下对经原代培养的培养基进行继代培养的步骤。

7.权利要求6所述的方法，其中所述原代培养进行24至144小时。

8.权利要求6所述的方法，其中所述继代培养在31至33℃下进行。