[发明专利]用于产生双功能蛋白质及其衍生物的方法

说明书

本发明提供了用于产生包含生物活性蛋白和FGF21突变蛋白的双功能蛋白质的方法。所述方法通过有效地阻止靶蛋白的分解允许稳定地产生靶蛋白，并因此具有高的商业应用潜能。

技术领域

本发明涉及用于产生包含生物活性蛋白和成纤维细胞生长因子21(FibroblastGrowth Factor 21，FGF21)突变蛋白的双功能蛋白质的方法。

背景技术

当使用动物细胞以产生重组蛋白时，可能存在靶蛋白的特定区域可被动物细胞(宿主细胞)分泌的蛋白酶剪切而导致重组蛋白的异质性、降低或失活的问题。另外，所表达蛋白的这样的剪切还导致在产生和纯化过程期间难以维持“批次之间(lot to lot)”同质性的问题。由于这个原因，在重组蛋白的产生期间将蛋白酶保持在低水平或抑制蛋白酶活性是必需的。

作为解决该问题的替代方案，提出了在培养基中添加针对丝氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸或氨基肽酶的抑制剂(例如抑蛋白酶多肽(aprotinin)、苯丁抑制素(bestatin)、亮抑蛋白酶肽(leupeptin)、E-64和胃蛋白酶抑制剂A(pepstatin A)等)的产生方法(参见WO1990-002175、EP 0,306,968和US 5,851,800)。然而，由于细胞毒性以及需要额外的努力来证明它们已从最终产品中完全去除，在商业生产中这些抑制剂的使用并不有效。另外，在常规替代方案中，尚未发现适用于宿主细胞中产生的所有靶蛋白的通用方法。

发明内容

技术问题

本发明的一个目的是提供用于产生包含生物活性蛋白和FGF21突变蛋白的双功能蛋白质的培养方法，其具有改善的药动学参数、高稳定性、较少的聚集形成复合物的潜能、以及较少的免疫原性潜能。

问题的解决方案

根据本发明的一个目的，提供了用于从用含有编码双功能蛋白质或其衍生物的cDNA的表达载体转化的哺乳动物宿主细胞产生重组双功能蛋白质的方法，所述方法包括在补充有硫酸葡聚糖的培养基中培养哺乳动物宿主细胞，其中所述双功能蛋白质包含：成纤维细胞生长因子21(FGF21)突变蛋白；生物活性蛋白或其突变体或片段；以及免疫球蛋白Fc区，其中所述FGF21突变蛋白包含选自以下突变(1)至(7)中的至少一种突变：

(1)从野生型FGF21蛋白的N端起第98至101位的氨基酸替换为氨基酸序列EIRP(SEQ ID NO：53)；

(2)从野生型FGF21蛋白的N端起第170至174位的氨基酸替换为氨基酸序列TGLEAV(SEQ ID NO：54)；

(3)从野生型FGF21蛋白的N端起第170至174位的氨基酸替换为氨基酸序列TGLEAN(SEQ ID NO：55)；

(4)从野生型FGF21蛋白的N端起第170位的氨基酸替换为氨基酸N；

(5)从野生型FGF21蛋白的N端起第174位的氨基酸替换为氨基酸N；

(6)从野生型FGF21蛋白的N端起第180位的氨基酸替换为氨基酸E，连同上述突变(1)至(5)中的一种或更多种；以及

(7)用于降低野生型FGF21蛋白之免疫原性的1至10个氨基酸的突变。

发明的有益效果

本发明的产生方法通过有效地阻止靶蛋白的分解允许稳定地产生靶蛋白。

附图简述

图1是示出在对表达双功能蛋白质的细胞系进行悬浮培养之后，通过SDS-PAGE分析培养物上清液的结果的示意图。发现随着培养时间的流逝，其他小于非经剪切双功能蛋白质的蛋白质一起表达。