[发明专利]使用胆汁醇葡糖苷酸和代谢物比率的脑腱黄瘤病筛查方法

说明书

本发明涉及诊断或筛查动物中27‑羟化酶(CYP27A1)缺陷的方法，该方法包括：在生物样本中通过质量分析至少胆汁醇葡糖苷酸和C24‑或C27‑胆汁酸或其缀合物来确定强度信号，将强度信号与对照样本或对照值进行比较，以及基于所述比较确定27‑羟化酶(CYP27A1)缺陷。

技术领域

本文所述的教导内容涉及筛查或诊断血样的脑腱黄瘤病的方法和试剂盒。

背景技术

脑腱黄瘤病(CTX)是由27-甾醇羟化酶(由CYP27A1基因编码)的缺陷引起的罕见的常染色体隐性障碍，其在胆汁酸合成中起关键作用。成人中CTX的特征在于渐进式神经表型。婴儿和儿童期间的症状包括新生儿胆汁淤积症、难以治疗的腹泻(可为呈现病征并且在出生后能够很快临床表现显著)、双边白内障和发育迟缓。从第二个十年到第三个十年起，观察到肌腱黄色瘤和神经精神症状，包括椎体和小脑征、周围神经病变和痴呆(1，2)。除了7α-羟基-4-胆固醇-3-酮的聚积之外，胆汁酸合成中的代谢块还导致一级胆汁酸胆酸(CA)，并且具体地，鹅去氧胆酸(CDCA)的缺陷。将7α-羟基-4-胆固醇-3-酮进一步转化为不同的代谢物，包括胆甾醇和特征胆汁醇。胆甾醇连同胆固醇聚积在组织中。虽然CTX的病理生理学仍未被充分理解，但据信是胆甾醇导致了大部分所观察到的病变。已显示胆甾醇诱导神经元细胞的凋亡，并且认为其聚积是所观察到的神经变性的基础(3，4)。能够通过补充CDCA来抑制或防止症状和病征的发展，CDCA通过反馈机制下调胆汁酸合成，所述反馈机制导致胆固醇-7α-羟化酶的抑制，从而防止胆甾醇的产生和聚积(5)。当早期开始疗法时，CTX的预后良好，但在稍后年龄开始时不太有利(6-9)。早期开始疗法能够完全防止神经表型，并且如果在新生儿诊断后立即开始治疗，则预期患者将保持无症状(7，10)。使用ExAC数据库中病原CTX变体的等位基因频率，在不同族群中估计的CTX发生率高达1:36,072至1:263,222(11)。该研究和其它研究表明，CTX可能被诊断不足(11，12)。总之，这使得CTX成为一种优异的候选疾病，尤其是对于新生儿筛查。然而，CTX新生儿患者的检测受到在干血点(DBS)中缺乏合适的新生儿筛查方法的阻碍。DeBarber和同事已使用LC-ESI/MS/MS方法，基于对DBS中酮甾醇中间体的定量，公布了一种用于CTX的候选高通量新生儿筛查方法(13，14)。潜在的缺点是在分析前需要衍生步骤，这使实施复杂化成现有的新生儿筛查程序，并且成本更高。

本发明的一个目的是提供诊断测试的筛查，该筛查不需要衍生步骤，并且灵敏度和特异性足以在大型筛查中检测CTX。

发明内容

本发明基于如下令人惊讶的发现：通过确定来自人的生物样本中胆汁醇葡糖苷酸和C24-或C27-胆汁酸或其缀合物的质量强度信号，可能使用不需要衍生步骤的方法来精确确定该人是否患有27-羟化酶(CYP27A1)缺陷。虽然已知胆汁醇葡糖苷酸在血浆CTX患者中提升(15)，但这些代谢物的水平在个体之间有变化。此外，这些代谢物的含量也偏离患有Zellweger综合征的患者和胆汁淤积症患者中的正常水平。因此，不可预测的是，质量强度信号是否将提供信息来在CTX患者和正常对照或患有其它疾病的患者之间进行区分。

首先调查了仅测量四醇是否足以将未治疗的新生儿(和成人)CTX干血点(DBS)与对照新生儿DBS进行区分。没有四醇的可商购获得的稳定同位素标记的内部标准物，并且将几种可商购获得的候选物作为内部标准物进行测试，即²H₄-t-CDCA、²H₄-g-CDCA、²H₄-t-CA、²H₄-g-CA和孕二醇葡糖苷酸(图2)。大多数患者中的四醇响应明显提升，但未完全与足月/早产对照物分离。如前所述，Zellweger患者和胆汁淤积性肝病患者也具有提升的胆汁醇水平(16，17)，并且在该实验中，无论使用哪种内部标准物，都无法通过仅测量四醇响应来将Zellweger患者与CTX区别开来(图2)。