[发明专利]分析物检测

说明书

本文提供了涉及检测分析物的技术，和特别但非排他地涉及使用基于检测探针的瞬时结合的技术检测分析物例如核酸、蛋白、小分子和其它分子的方法、系统、组合物和试剂盒的技术。

本申请要求2017年3月8日提交的美国临时专利申请系列号62/468,578的优先权，所述临时专利申请通过引用以其整体结合到本文中。

关于联邦资助研究或开发的声明

本发明在美国国立卫生研究院授予的资助GM062357下和在美国海军海军研究办公室授予的资助W911NF-12-1-0420下在政府支持下完成。政府具有本发明的某些权利。

领域

本文提供了涉及检测分析物的技术，和特别但非排他地涉及使用基于检测探针的瞬时结合的技术检测分析物例如核酸、蛋白、小分子和其它分子的方法、系统、组合物和试剂盒。

背景

检测和定量复杂的混合物中的低浓度分析物在生物学研究和临床诊断中具有许多应用。许多重要的生物学分析物是疾病和其它生物学状态的生物标志物。例如，在血液、尿、唾液和其它体液中少部分的携带致癌突变的循环核酸的检测与某些类型的癌症的发生率相关。此外，蛋白分析物例如前列腺特异性抗原(PSA)和白介素也具有当前或潜在的临床和研究意义。小分子代谢物的水平提供了在生物学系统中关于健康和药物处理的信息。在分子诊断和研究中抗体、适体、核酸和其它亲和试剂广泛用于这些测定。

低丰度分子分析物的检测中的挑战是灵敏度和特异性之间的权衡。即，随着测定的灵敏度增加，假阳性的可能性增加，这降低了特异性。例如，普通ELISA (酶联免疫吸附测定)方法中的假阳性起因于第一或第二抗体与测定表面的非特异性结合，因此当预期的靶分析物不存在时产生信号。在这样的情况下，改进检测器灵敏度或信号放大效率增加真阳性和假阳性检测事件二者，导致更低的特异性。尽管已开发策略来降低假阳性事件，包括用封闭溶液孵育表面、严格性洗涤方案和使用必须共同结合靶分析物以产生信号的分裂探针，然而当前方法遭受到假阳性，因为在实践中假阳性信号不能完全被消除。结果是，对于许多类型的生物标志物，在单分子水平上以高特异性检测靶分析物仍然是困难的。

简述

之前已经描述了使用查询探针的瞬时结合的强度对比时间数据的动力学建模和分析检测核酸的策略(参见Johnson-Buck等(2015) Nat. Biotechnol. 33: 730-32; 美国专利申请公开号20160046988; 国际专利申请号PCT/US2017/016977，其各自通过引用以其整体结合到本文中)。相比之下，本发明的技术在一些实施方案中提供一种通过确定低亲和力查询探针的每个结合和解离事件的空间和时间坐标，然后按位置簇集结合事件，和使每个簇事件经历动力学分析(例如，确定每单位时间每个靶分子的事件数量或事件之间停留时间的平均数、中值、最大值、最小值、标准偏差或其它度量)，检测与表面稳定结合的靶分析物的新方法。该方法允许区别非特异性探针结合和探针与靶分析物的结合，这是因为在查询探针与单个靶分析物的多个结合事件上的位置对比时间统计学累积得到在分析物的身份方面比任何以下各项更大的置信度：单一结合事件、跨越观察区域的结合事件的累积计数或跨越观察区域的探针信号的累积计数。此外，该方法使用基于强度波动(而不是总体信号强度)的空间位置信息和簇集来超越检测装置的分辨率极限，以提供“超分辨率”测量。因此，在一些实施方案中该技术提供比之前公开的方法更高的动态范围(图2)，和检测探针与靶分析物的特异性结合和检测探针与成像表面或其它表面结合分析物的非特异性结合的区别力的改进(图3)。特别地，来自靶标结合的信号的紧密簇集的空间定位和探针与靶标结合的独特动力学行为用于提供靶标信号与非特异性(例如，假阳性)信号的区别力的改进。在一些实施方案中，当应用于大的检测器区域上的查询探针结合事件时，该方法可用于在单分子水平上数字计数一种或多种靶分析物。

该技术提供超过现有技术的优点，包括但不限于，改进分析物相对于背景结合的区别力；改进密切相关的分析物之间的区别力；和极度稀释或低体积样本的分析(例如，相对于分析相同分析物的现有技术，灵敏度和/或特异性改进)。