[发明专利]用于制备核酸文库的方法和组合物有效
| 申请号： | 201880031331.8 | 申请日： | 2018-03-16 |
| 公开（公告）号： | CN110612351B | 公开（公告）日： | 2023-08-11 |
| 发明（设计）人： | 陈锡君;塔伦·库拉纳 | 申请（专利权）人： | ILLUMINA公司 |
| 主分类号： | C12N15/10 | 分类号： | C12N15/10 |
| 代理公司： | 北京英赛嘉华知识产权代理有限责任公司 11204 | 代理人： | 王达佐;洪欣 |
| 地址： | 美国加利*** | 国省代码： | 暂无信息 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 用于 制备 核酸 文库 方法 组合 | ||
1.制备核酸文库的方法，包括：
(a) 获取多个核酸，其中所述多个核酸是单链核酸；
(b) 将所述单链核酸的5′端脱磷酸化；
(c) 在连接酶存在下，将第一衔接子与所述单链核酸的3′端连接，其中所述第一衔接子的3′端包含封闭基团；
(d) 通过使未连接的单链第一衔接子与捕获探针杂交，去除未连接的单链第一衔接子；
(e) 使所述连接的单链核酸的5′端磷酸化；以及
(f) 在所述连接酶存在下，将第二衔接子与所述磷酸化的连接的单链核酸的5′端连接，从而得到核酸文库，
其中所述捕获探针的3′端和5′端包含封闭基团。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述第二衔接子的5′端是非磷酸化的。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述第二衔接子附接于基底。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述基底包含珠或流动室。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述捕获探针位于溶液中。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述捕获探针包含与所述第一衔接子的至少一部分互补的序列。
7.如权利要求1所述的方法，其中使所述连接的单链核酸的5′端磷酸化包括使所述连接的单链核酸与激酶接触。
8. 如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中步骤(b) – (f)在单个反应体积中进行。
9. 如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中步骤(b) – (f)在单个反应容器中进行。
10.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述第一衔接子和/或第二衔接子包含测序引物结合位点。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述第一衔接子包含P7序列、P5序列或者其互补序列或反向互补序列。
12.如权利要求10所述的方法，其中所述第二衔接子包含P7序列、P5序列或者其互补序列或反向互补序列。
13.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述第一衔接子和/或第二衔接子包含衔接子索引。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述第一衔接子索引不同于所述第二衔接子索引。
15.如权利要求13所述的方法，其中所述衔接子索引指示所述多个核酸的来源。
16.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述封闭基团包含3'-间隔子C3或双脱氧核苷酸。
17.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述连接酶包含单链核酸连接酶。
18.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述第一衔接子的连接和/或所述第二衔接子的连接是在体积排除试剂存在下进行的。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述体积排除试剂选自：聚乙二醇(PEG)、葡聚糖、羟乙基淀粉、Ficoll和聚乙烯吡咯烷酮。
20. 如权利要求18所述的方法，其中所述第一连接步骤和/或第二连接步骤在包含至少37% (wt/vol) PEG的反应体积中进行。
21. 如权利要求18所述的方法，其中所述第一连接步骤和/或第二连接步骤在包含至少60% (wt/vol) PEG的反应体积中进行。
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