[发明专利]用于制备核酸文库的方法和组合物

说明书

本文提供的系统、方法和组合物涉及制备核酸文库。一些实施方案包括通过连接单链核酸制备核酸文库。

相关申请

本申请要求2017年3月20日提交的名称为“用于制备核酸文库的方法和组合物”的美国临时申请62/473595号的优先权；将其公开的内容通过援引的方式整体并入本文。

序列表

本申请包含电子格式的序列表。所提供的序列表文件名为“ILLINC362WOSEQLIST”，创建于2018年3月15日，其文件大小约为4kb。将电子格式序列表中的信息通过援引的方式整体并入本文。

发明领域

本文提供的系统、方法和组合物涉及制备核酸文库。一些实施方案包括通过连接单链核酸制备核酸文库。

发明背景

数种二代测序技术可用于快速、经济地确定基因组的整个序列。通常，在测序前由双链靶基因组DNA样品制备模板核酸文库。样品制备通常包括DNA片段化步骤，将较大的DNA链断裂为较小的DNA片段，较小的DNA片段更适合于二代测序技术。通常，衔接子附接在DNA片段的末端，这可以通过在DNA末端修复后进行衔接子连接来完成，或者最近通过使用转座体系统来完成。转座体是转座酶和转座子序列的复合体，使用转座体可以同时进行基因组片段化和片段的衔接子连接，从而简化了文库的制备。文库制备方法通常是劳动密集型的，并且在不同的阶段需要几个动手步骤。

发明概述

一些实施方案包括制备核酸文库的方法，包括：(a)获取多个核酸，其中所述多个核酸是单链核酸；(b)将所述单链核酸的5′端去磷酸化；(c)在连接酶存在下，将第一衔接子与所述单链核酸的3′端连接，其中所述第一衔接子的3′端包含封闭基团；(d)使所述连接的单链核酸的5′端磷酸化；以及(e)在所述连接酶存在下，将第二衔接子与所述磷酸化的连接的单链核酸的5′端连接，从而得到核酸文库。

在一些实施方案中，所述第二衔接子的5′端是非磷酸化的。

在一些实施方案中，所述第二衔接子附接于基底。在一些实施方案中，所述基底包含珠或流动室。

一些实施方案还包括在步骤(e)之前去除未连接的单链第一衔接子。

一些实施方案还包括使所述未连接的单链第一衔接子与捕获探针杂交。在一些实施方案中，所述捕获探针包含与所述第一衔接子的至少一部分互补的序列。在一些实施方案中，所述捕获探针的3′端包含封闭基团。在一些实施方案中，所述捕获探针的5′端包含封闭基团。

一些实施方案还包括消化所述未连接的单链第一衔接子。在一些实施方案中，消化所述未连接的单链第一衔接子包括使所述未连接的单链第一衔接子与5′-磷酸依赖性核酸外切酶接触。在一些实施方案中，消化所述未连接的单链第一衔接子包括使所述未连接的单链第一衔接子与5′-磷酸依赖性核酸外切酶和5′-去腺苷化酶接触。

在一些实施方案中，使所述连接的单链核酸的5′端磷酸化包括使所述连接的单链核酸与激酶接触。

一些实施方案包括制备核酸文库的方法，包括：(a)获取多个核酸，其中所述多个核酸是双链核酸；(b)使所述双链核酸与5′-核酸外切酶接触，以获取多个具有单链3′-悬突的修饰的双链核酸；(c)在连接酶存在下，使第一衔接子与所述修饰的双链核酸的3′端连接，其中所述第一衔接子的3′端包含封闭基团；(d)使与所述第一衔接子连接的所述修饰的双链核酸去杂交(dehybridizing)，以获取多个单链核酸；以及(e)在所述连接酶存在下，使第二衔接子与所述单链核酸的5′端连接，从而得到核酸文库。

在一些实施方案中，所述第二衔接子的5′端是非磷酸化的。