[发明专利]对PCSK9基因中的识别序列具有特异性的工程化大范围核酸酶

说明书

本发明包括工程化大范围核酸酶，其识别和切割人PCSK9基因内的识别序列。本发明还包含用于在药物组合物中和在用于治疗或减轻胆固醇相关障碍(例如高胆固醇血症)的症状的方法中使用这种工程化大范围核酸酶的方法。此外，本发明包括包含工程化大范围核酸酶蛋白、编码工程化大范围核酸酶的核酸的药物组合物以及这种组合物用于治疗与胆固醇相关障碍例如高胆固醇血症的用途。

技术领域

本发明涉及分子生物学和重组核酸技术领域。特别地，本发明涉及对PCSK9基因内的识别序列具有特异性的工程化大范围核酸酶。这种工程化大范围核酸酶可用于治疗心血管疾病和高胆固醇血症(包括常染色体显性家族性高胆固醇血症)的方法中。

通过EFS-WEB作为文本文件提交的序列表的引用

本申请包含序列表，其已经通过EFS-Web以ASCII格式提交，并且将其全部内容按引用并入本文中。2018年4月20日创建的所述ASCII拷贝命名为P109070022WO00-SEQTXT-MJT，并且大小为89,660字节。

背景技术

与高水平的低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)相关的心血管疾病是发达国家中的主要死亡原因，而LDL-C水平升高是冠状动脉疾病(CHD)和动脉粥样硬化斑块形成的主要危险因素。例如，家族性高胆固醇血症(FH)是特征在于高胆固醇水平，尤其是高LDL-C水平，以及发生早发性CHD的遗传障碍。杂合型FH患者通常用降血脂药(如他汀类药物)治疗，这些药物降低总胆固醇水平和特别是LDL-C水平。事实上，他汀类药物的使用已大大降低了某些患者人群中的心血管疾病的风险。但是，某些患者人群，特别是具有纯合形式FH的那些人群，无法响应于药物治疗(包括高剂量他汀类药物)而实现正常的LDL-C水平。

降脂领域的重大进步是靶向原蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin9型(PCSK9)的疗法的开发。人PCSK9基因位于染色体1p32.3上，长度为25,378bps。它包含编码692个氨基酸的12个外显子。PCSK9蛋白包含信号肽、前结构域、催化结构域和C末端富含半胱氨酸-组氨酸的结构域，其由3个模块(M1、M2和M3)组成。

尽管PCSK9在胃肠道、肾脏和中枢神经系统(CNS)中的表达水平较低，PCSK9的合成、分泌和表达主要在肝脏中发生。PCSK9前体蛋白的分子量为75kDa。在内质网(ER)中自动催化裂解后，PCSK9前结构域与62kDa的成熟PCSK9蛋白分离。分离的前结构域仍与成熟的PCSK9蛋白保持非共价结合，形成前片段(prosegment)-PCSK9复合物，其迫使PCSK9催化结构域变为非活性构象。然后切割的复合物从ER转运至高尔基器并释放。在肝脏细胞中，分泌的PCSK9与肝细胞膜上的LDL受体结合。这种结合通过PCSK9催化结构域和前结构域分别与LDL受体的表皮生长因子样重复同源结构域A(EGF-A)和β-推进器结构域(propellerdomain)的相互作用介导。

LDL受体通常将细胞外液中的脂肪分子(包括胆固醇)转运到细胞中，从而降低循环LDL浓度。在不存在PCSK9的情况下，LDL受体-配体复合物发生构象变化，其允许LDL的细胞内传递以及LDL受体重循环回到细胞表面。但是，PCSK9与LDL受体的结合阻止了复合物的这种构象变化，并将该受体引导至溶酶体进行降解。结果，较少的LDL受体存在于细胞表面上，这随之增加血流中的循环LDL胆固醇水平。除LDL受体外，PCSK9还显示介导相同家族中的其他脂质受体的降解，包括极低密度的脂蛋白(VLDL)受体、载脂蛋白E受体2和LDL受体相关蛋白1。

连同编码LDL受体和载脂蛋白B的基因，PCSK9是与常染色体显性形式的FH相关的第三个基因。在常染色体显性FH中，PCSK9基因中的功能获得性突变进一步降低LDL受体在细胞表面的定位，并已与LDL胆固醇水平升高相关。有趣的是，已观察到在具有低LDL胆固醇水平和显著降低的心血管事件发生率的受试者中发现了PCSK9中的功能丧失性突变。此外，PCSK9功能丧失的患者显示出对他汀类治疗的反应升高。