[发明专利]纯化白蛋白融合蛋白的方法

说明书

本发明提供了通过从白蛋白融合蛋白溶液中去除杂质来提高白蛋白融合蛋白溶液的质量的色谱分离方法。本发明提供了(黄色)有色杂质和HCP的量显著减少的白蛋白融合蛋白溶液。

技术领域

本发明涉及蛋白质纯化领域，具体而言，其涉及从白蛋白融合蛋白溶液中去除杂质的方法。

发明背景

白蛋白融合蛋白已得到充分研究，并广泛应用于生物制药中。白蛋白融合蛋白的一种常见应用是延长治疗性蛋白质和肽的血浆半衰期。一个这样的例子是巨噬细胞抑制性细胞因子-1(MIC-1)白蛋白融合蛋白，例如在WO/2015/197446和WO 2015/198199中所描述的。

白蛋白融合蛋白溶液通常含有会影响白蛋白融合蛋白产品质量和视觉外观的杂质。有色杂质，通常是黄色杂质，尤其与白蛋白融合蛋白溶液相关。

先前已经采用诸如热处理、疏水相互作用色谱法(HIC)、活性炭过滤(US2011027221)等方法来尝试改善白蛋白溶液的质量和视觉外观。然而，这些方法并不十分有效，因此需要替代的纯化方法。

发明内容

本发明提供了通过减少杂质含量来提高白蛋白融合蛋白溶液的质量的方法。在一个方面，本发明涉及从白蛋白融合蛋白溶液中去除杂质，如黄色杂质和宿主细胞蛋白质(HCP)杂质的色谱分离方法。

在一个方面，本发明的纯化白蛋白融合蛋白水溶液的方法包括以下步骤：(i)将所述融合蛋白溶液加载到包含阳离子交换色谱树脂的柱上，以及(ii)用含阳离子的梯度从所述柱上洗脱所述融合蛋白。

在一个实施方案中，所述白蛋白融合蛋白是MIC-1人血清白蛋白融合蛋白(HSA-MIC-1)。

在一个实施方案中，所述含阳离子的梯度是含Ca²⁺的梯度。

在一个实施方案中，所述洗脱缓冲液的pH为4.0-5.0。在进一步的实施方案中，所述洗脱缓冲液的pH为4.6、4.5、4.4、4.3、4.2或4.0。

在一个实施方案中，所去除的杂质包含黄色杂质。

在一个方面，本发明涉及产生白蛋白融合蛋白的方法，其中该方法包括以下步骤：

(i)在溶液中表达白蛋白融合蛋白，以及

(ii)将所述融合蛋白溶液加载到包含阳离子交换色谱树脂的柱上，及(ii)以Ca²⁺浓度逐渐增加的梯度从所述柱上洗脱所述融合蛋白。

在一个实施方案中，所述生产方法的白蛋白融合蛋白是MIC-1人血清白蛋白融合蛋白。

本发明的工业意义涉及蛋白质纯化的优化。优化纯化的目的是获得将在商业上使用的终产物，该终产物包含白蛋白融合蛋白溶液，其中的杂质含量，尤其是黄色杂质和HCP杂质的含量降低且得到更好的控制。

附图说明

图1显示了在不同pH值下的洗脱。在较低的pH下，保留时间延长，从而改善了HCP的减少(如实施例6中所述)。

发明详述

本发明的发明人已经开发了从白蛋白融合蛋白溶液中有效去除杂质，如HCP和黄色杂质的方法。

在一个方面，本发明涉及纯化步骤，其中将白蛋白融合蛋白溶液加载到阳离子交换色谱树脂上，并且在用含阳离子的梯度洗脱过程中分离并去除大量的HCP和黄色杂质。

白蛋白融合蛋白