[发明专利]用于改进编索引的核酸文库中的样品鉴定的组合物和方法

说明书

本发明涉及组合物和方法，所述组合物和方法用于通过在扩增和测序之前，通过外切核酸酶处理和任选地封闭从多个样品汇集的编索引(pooled indexed)的多核苷酸的3’末端来提高用于多重下一代测序的编索引的核酸文库制备物中的正确样品鉴定率。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2017年4月23日提交的美国临时申请序列号62/488,825的权益，该美国临时申请通过引用并入本文。

领域

本公开内容尤其涉及对来自多个文库的多核苷酸的测序；并且更特别地，涉及增加测序正确地鉴定出多核苷酸所源自的文库的可能性。

背景

下一代测序(NGS)技术的改进已经极大地提高了测序速度和数据输出，导致了目前测序平台的大量样品通量。大约10年前，Illumina基因组分析仪每次运行能够生成高达1千兆字节的序列数据。如今，Illumina NovaSeq^TM系列系统能够在两天内生成高达2兆兆字节的数据，这代表容量增加了2000×以上。

实现这种增加的容量的一个方面是多重化(multiplexing)，多重化在文库制备期间将称为索引(index)的独特序列添加到DNA片段。这允许在单次测序运行期间同时汇集大量文库并测序。随来自多重化的通量增加发生的是增加的复杂性层次，因为在最终数据分析前，需要在被称为去多重化(demultiplexing)的过程中通过计算对来自汇集的文库的测序读段进行鉴定和排序。去多重化的文库之间的索引错误分配是一个已知的问题，其从开发样品多重化时就已经影响了NGS技术(Kircher等人,2012,Nucleic Acids Res.,第40卷,第1期)。

本申请的概述

当测序的DNA文库分子包含与文库制备期间存在于文库衔接子中的索引序列不同的索引序列时，观察到索引跳跃(index hopping)或索引跳跃(index jumping)。索引跳跃可能发生在样品制备期间或在汇集的去多重化文库的簇扩增期间。引起索引跳跃的一种机制涉及文库制备后存在的游离未连接的衔接子分子的存在。

不意图受理论限制，索引跳跃的问题具有多种模式，一些模式涉及从文库制备遗留的剩余未连接的衔接子分子和/或不完整产物的存在。一种类别的索引跳跃可能由存在于文库池中的具有特异性通用延伸引物序列(例如P7’)的游离未连接的衔接子分子引起，这些游离未连接的衔接子分子可能促进具有交换的索引的文库的形成。这个问题可以通过使用特异性靶向待降解的P7’衔接子链的5’外切核酸酶来防止。例如，这可以通过使用对偏好消化双链5’末端的外切核酸酶，或通过使用偏好外切核酸酶介导的衔接子DNA分子的降解的5’末端修饰来实现。

在一个实施方案中，文库制备后存在的游离未连接的P7’衔接子分子可以退火至基底诸如流动池上的固定的表面P7引物，并且用作模板以产生更长的、修饰的、包含特异性索引序列(例如i7)和共有通用引物结合序列的固定的表面引物。然后该修饰的表面引物将与文库分子在索引分子3’的衔接子区域具有互补性，允许产生具有不同于原始文库分子的i7索引序列的表面结合的文库分子。

索引跳跃的这种机制可以通过使用5’外切核酸酶以选择性降解未连接的P7’衔接子分子来减少或消除。选择性降解的一种模式包括使用具有偏好降解双链DNA分子的5’至3’外切核酸酶活性的5’外切核酸酶。这种方法可以被用于使用叉形衔接子(forkedadaptor)的文库制备方法的背景中，所述叉形衔接子具有一个双链末端(可能包含短的3’突出端(overhang))和一个“叉形”单链末端。在连接至样品插入物文库后，所得的文库在两个末端上包含单链“叉形”区域。一些包含双链末端的未连接的衔接子分子继续存在。然后这种衔接子分子的P7’链可以通过使用偏好消化双链DNA的的5’至3’外切核酸酶而被靶向降解。选择性靶向5’磷酸化双链末端的5’至3’外切核酸酶的使用有助于将外切核酸酶的活性范围缩小至(narrowing)未连接的衔接子。