[发明专利]在真菌里氏木霉中恢复有性繁殖的方法

说明书

本发明涉及一种使用辅助菌株ΔMAT在里氏木霉的两个雌性不育菌株之间恢复有性繁殖的方法，所述辅助菌株是其中已消除有性型基因座MAT的里氏木霉的雌性可育菌株。

技术领域

本发明涉及一种在真菌里氏木霉(Trichoderma reesei)的两个雌性不育菌株之间恢复有性繁殖的方法。

背景技术

里氏木霉是木霉属的一种纤维素分解丝状真菌，第二次世界大战期间在南太平洋被发现。这种真菌能够分泌大量纤维素的酶(纤维素酶和半纤维素酶)，目前主要用于第二代生物燃料生产循环。实际上，由这种真菌产生的酶对于将植物生物质转化为工业上有用的生物产品如生物乙醇特别有用。

第二代生物燃料(源自非食品资源)目前特别受关注，因为第一代生物燃料(源自食品资源)由于与食品生产竞争而只能以有限量生产。

生产第二代生物燃料的方法包括四个主要步骤：木质纤维素生物质的预处理、木质纤维素生物质的酶水解、发酵和蒸馏。

尽管可以而且必须优化第二代生物燃料生产的所有步骤(以增加产量)，但酶水解步骤还是要特别强调。该水解步骤涉及由丝状真菌里氏木霉产生的纤维素酶型酶。

更一般地，里氏木霉可以用作生产工业上同源或异源蛋白质的平台菌株。为了优化里氏木霉的性能，必须改善产生目标蛋白的里氏木霉菌株。

因此，在为降低水解成本而设想的改进方法中，里氏木霉的基因工程是一种解决方案。它可以改善产生纤维素酶的丝状真菌的分泌性能品质和酶的性质，并可以在工业条件下控制菌株的稳定性。

诱变是基因疗法中常用的一种技术。它旨在有意地将突变引入DNA中，以产生基因修饰的基因。这使得可以产生的菌株具有从工业角度来看有利的特性。通常有两种诱变方法将突变引入里氏木霉：随机诱变和定点诱变。

随机诱变在于在DNA中的任何位置诱导非靶向突变。这些突变通过将目标生物暴露于化学诱变剂或辐射引起。鉴于突变是自然现象，因此随机诱变被认为是这种自然过程的加速器，并且所产生的生物被认为是自然的而不是转基因生物(GMO)；因此，它们不具有可追溯性义务。但是，除了负责目标特征的突变外，这种方法还会导致大量不需要的突变(称为“附带”突变)，其通过累积导致不稳定性、健康状况不良，甚至导致突变生物的死亡。

定点诱变能够将鉴定出的突变引入精确基因。为此，合成包含突变的目标DNA，然后将其引入待突变的细胞中，在其中DNA修复机制负责将其整合到基因组中。使用可选择标记能够相对于未整合突变的细胞鉴定已整合突变的细胞。然而，经历这种诱变的生物被认为是GMO(由于引入了外源DNA)，因此具有可追溯性义务。

因此，在使用里氏木霉生产第二代生物燃料的情况下，通过将突变(随机或定点)引入里氏木霉来改进水解步骤并不令人满意，因为造成不良突变的积累，或者由于外源DNA的引入。因此，需要一种改进水解步骤的新方法。

因此，本发明的发明人开发了一种利用里氏木霉的有性繁殖来改善里氏木霉的性能品质的新方法。目前，里氏木霉的有性繁殖从未被用作改善的工具，因为一直认为里氏木霉不能进行有性繁殖。尽管如此，在里氏木霉中性征的发现(Seidl等，2009)为菌株的遗传改良开辟了新的可能性。有性繁殖尤其有可能创造遗传多样性、保存有益的突变并从基因组中删除“附带”突变。

里氏木霉是一种被称为异宗的真菌，即，只有在相配的交配型个体(MAT1-1和MAT1-2)之间才能进行有性繁殖。此外，里氏木霉是雌雄同体，即，一个菌株会同时产生雄性和雌性的性器官(图1)。

两个可育的且相配的里氏木霉天然分离株之间的有性繁殖产生包含子代的子座(图2A)。

为了测试工业菌株的有性繁殖，通过基因工程构建了菌株QM6a MAT1-1(Seidl等，2009)。相配的QM6a菌株之间的有性繁殖无法获得子座，因为这些菌株是不育的雌性菌株(图2B)(Seidl等，2009)。