[发明专利]免疫比浊法测定钙结合蛋白S100家族成员的方法

权利要求书

1.一种测定患者的生物样品中的钙卫蛋白的存在的体外方法，包含以下步骤：

a)收集预定量的所述生物样品；

b)在预定量的水性有机缓冲液中溶解和提取所述生物样品，所述水性有机缓冲液具有i)pH值介于5.0和6.0之间，ii)渗透压至少为150mosmol/kg·H₂O，iii)0.01至0.1％(按重量计)的阴离子表面活性剂，iv)其中所述有机缓冲液与钙和锌离子配位和螯合，以及iv)和，任选地，均质化和提取所述生物样品材料，然后去除任何颗粒物质以获得具有溶解的基本上为异二聚钙卫蛋白(S100A8/A9)的样品溶液；

c)将定义量的步骤(b)的所述样品溶液与一定量的试剂混合以获得以定义的分子状态存在的钙卫蛋白(S100A8/A9)的颗粒结合抗体抗原反应，所述试剂包含固定化两种或多种单克隆抗体或其片段的纳米颗粒，所述单克隆抗体或其片段特异结合S100A8和S100A9中的任一种或钙卫蛋白(S100A8/A9)；

d)将步骤c)的混合物孵育一段时间；和

e)获取混合物的光学性质并基于混合物的光学性质确定指示钙卫蛋白(S100A8/A9)含量的信号；

f)将所述含量与校准对照品相关联，并基于测得的所述生物样品中存在的钙卫蛋白(S100A8/A9)评估所述患者的临床状况。

2.根据权利要求1所述的钙卫蛋白测定方法，其测定量在计量学上可追溯至从具有完整溶酶体室的粒细胞中分离的并由多克隆单特异性抗体测定的钙卫蛋白标准品。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中获取光学性质的步骤e)中包含测定吸光度、透射率、反射率、光散射、荧光或闪烁值。

4.根据权利要求3所述的方法，其是比浊法或免疫比浊分析法。

5.根据权利要求4所述的方法，其是颗粒增强免疫比浊法(PETIA)，其中步骤b)和c)包含使用两种试剂组分。

6.根据权利要求5所述的方法，包含使用直径为150至350nm的纳米颗粒以增加灵敏度。

7.根据权利要求6所述的方法，其中抗体与两种类型的颗粒结合，所述两种类型的颗粒具有均匀的直径，其范围为i)150-200nm和ii)250-350nm，以增大测量范围。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述颗粒为羧化聚苯乙烯或氯甲基活化的聚苯乙烯颗粒。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中生物样品为粪便或粪便提取物。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述缓冲液组合物由至少一种盐组成，所述盐选自包含以下项的组：多羧酸、三羧酸、乌头酸、丙三羧酸、二羧酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、己二酸、庚二酸、α-羟基羧酸、β-羟基羧酸和γ-羟基羧酸、羟基二羧酸、苹果酸、柠檬酸、酒石酸、丙二酸、葡萄糖酸、5-酮葡萄糖酸、2-酮葡萄糖酸、二羟基马来酸、马来酸、富马酸、氨基三乙酸、乳酸和/或抗坏血酸。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中颗粒结合抗体抗原反应在pH值介于5.0至6.0之间且包含阴离子表面活性剂或十二烷基硫酸钠和Ca²⁺配位缓冲液分子的混合物中进行。

12.根据权利要求11所述的方法，其中步骤b)的钙螯合缓冲液包含柠檬酸盐、乙酸盐或马来酸盐中的至少一种盐、蛋白酶处理血清白蛋白和0.01至0.1％(按重量计)的阴离子表面活性剂。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，包含添加或存在非特异的IgM抗血清。

14.根据权利要求1至8和10至13中任一项所述的方法，其中所述生物样品为血液、血清或血浆。

15.一种检测试剂盒，用于通过上述权利要求1至14中任一项公开的颗粒增强免疫比浊法测定生物样品中的钙卫蛋白的存在，其包含第一水性试剂组分，所述第一水性试剂组分包含：

-20至1000mmol/L有机缓冲液，pH值介于5.0至6.0之间；

-50至300mmol/L钠盐、钾盐或锂盐；

-0.1至1.5％蛋白酶处理血清白蛋白；

-0.01至0.1％(w/v)十二烷基硫酸钠，和

任选地，β-醛糖、丙糖、丁糖、戊糖、己糖、聚葡萄糖、葡聚糖和/或白糖，以达到至少200mmosM/L的渗透压；

以及第二试剂组分，所述第二试剂组分包含0.01至0.5％(w/v)直径为150至350nm的乳胶颗粒，所述乳胶颗粒携带有结合S100A8和S100A9中的任一种或钙卫蛋白(S100A8/A9)的固定化单克隆抗体。