[发明专利]一种测试基因治疗载体的方法

说明书

一种在基因治疗载体在个体上开始基因治疗前确定其安全性和/或功效的方法，该方法包括用基因治疗载体感染从个体中获得的诱导多能干细胞的培养物。理想的，允许细胞分化，并在培养开始时感染，以及在分化期间和/或分化之后至少感染一次。从感染的细胞中提取核酸，然后分析核酸以测量和/或确定，来自所述载体的核酸的整合的不利影响和/或来自所述载体的核酸表达的效率。

本发明涉及一种确定基因治疗载体的安全性和/或功效的方法。本发明尤其涉及具体确定基因治疗的安全性、其副作用和长期成功的基因表达。

基因治疗是一种通过将携带基因的载体材料永久整合到细胞宿主基因组中来提供治疗基因的有前途的方法，其中所述细胞宿主基因组要求纠正基因增强。

在此过程中，功能齐全的基因可用于治疗或纠正遗传疾病，其中患病宿主中的现有基因发生突变，因此不会产生功能蛋白。基因治疗可以提供基因，该提供的基因为正常细胞功能或疫苗接种提供蛋白质，或通过使靶肿瘤细胞死亡来治疗癌症。将核酸整合到靶宿主基因组中的基因治疗载体包括病毒，例如腺相关病毒载体(AAV)、反转录病毒(RV)及其亚组。这些病毒喜欢将自己插入开放染色质中。开放染色质是基因处于转录所需的开放或解链构型的地方。代表正在表达的基因的这种构型允许基因治疗载体进入进行插入。已经显示出高表达的基因是载体插入的优选靶标(Kustikova等人(2009)，Wu等人(2003)，Nowrouzi等人(2013))。整合过程需要切割宿主DNA，以便可以插入病毒载体携带的核酸，然后在病毒核酸与宿主连接后，宿主DNA修复基因对这一过程进行修复。

基因治疗先前饱受挫折，其中接受过严重综合免疫缺陷治疗的儿童发展为白血病。发现这与由反转录病毒携带的治疗基因有关，该反转录病毒被插入癌基因中，引起其表达的改变并导致携带整合基因的癌细胞的克隆生长。此后，设计了几种体外和体内模型，以鉴定与载体相关的促成因素及其与宿主的相互作用，从而导致细胞克隆生长和致癌作用。

这些已知的促成因素包括载体启动子或增强子介导的宿主局部基因的激活(据信距离插入位点约100kb)，在载体和宿主基因之间剪接，从而产生可能在表达上不受控制的截短的基因；载体通读，其中载体内的启动子继续驱动宿主基因接近载体插入的表达；并通过宿主固有免疫系统使载体和宿主基因甲基化。通过使DNA甲基化，宿主固有免疫反应旨在感染后控制外来载体的表达，使其沉默，但是这也会导致其自身基因的甲基化，从而使得控制细胞自动调节的许多重要基因的宿主中的基因表达发生改变。

申请人先前已经开发了一种体内模型，其中用插入表达的宿主基因中的反转录病毒亚型慢病毒(LV)治疗胎儿小鼠。允许这些动物出生，从而使在发育过程中表达的基因暴露于基因治疗载体整合中。发现经常选择高度表达的基因进行整合，同时发现这些小鼠继续发展为肝肿瘤。申请人还发现，这种LV插入发生在发育过程中的某一时期，甚至在出生后(感染后长达5天)(Nowrouzi等人(2013))。在胎儿小鼠中，发育基因包括那些参与增殖、生长和分化的基因，并且这些基因高度表达。这些类型的基因也被称为癌症基因或原癌基因，通常在出生后就被关闭。因此，怀疑将病毒遗传物质整合到这些基因中并诱变这些基因已成为这些动物发展为癌症的原因。

本发明寻求提供一种确定基因治疗载体的安全性和/或功效的改进方法。

根据本发明的一个方面，提供了一种确定基因治疗载体的安全性和/或功效的方法，该方法包括：用基因治疗载体感染诱导多能干细胞的培养物；从感染的诱导多能干细胞中提取核酸；分析核酸以测量和/或确定载体整合的不利影响和/或载体的基因表达效率。

该模型模拟了发育过程中的情况，其中表达的基因参与了增殖、发育和分化。因此，该方法允许测试与癌症控制基因有关的载体。该方法在体外进行，并提供了另一种使用动物测试基因治疗载体的方法。

诱导多能干细胞优选地来自需要基因治疗的个体的细胞(Kane等人(2010))。在一个实施例中，可以由另一个人提供细胞以测试载体的副作用。载体优选携带个体可能需要或可能不需要的校正基因，以及其表达所需的任何核酸元件。在一些实施例中，载体携带报告基因(以及其表达所需的任何核酸元件)。