[发明专利]检测突变基因的方法

权利要求书

1.一种用于基于使用DNA聚合酶的核酸扩增反应中扩增产物的存在或不存在来检测核酸样品中包含的基因突变的方法，该方法包括以下步骤：

在核酸扩增反应溶液中，其中第一引物组与第二引物组共存，其中所述第一引物组设计成在基因多态性位点侧翼，所述第二引物组包含一个或多个用于从含有突变的核酸中选择性扩增的等位基因特异性引物，

(a)在防止第二引物组的核酸扩增反应的条件下，在竞争性核酸的存在下，通过第一引物组的核酸扩增反应扩增包含突变等位基因的核酸，获得扩增产物，所述竞争性核酸具有该基因的野生型等位基因序列，并与全部或部分所述多态性位点杂交，和

(b)使用获得步骤(a)的扩增产物时比第二引物组的引物浓度降低的第一引物组的引物浓度，进行扩增反应；和

(c)在允许至少第二引物组作用于步骤(a)中获得的扩增产物的条件下，通过核酸扩增反应选择性地扩增包含突变等位基因的核酸。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述防止第二引物组的核酸扩增反应的条件是所述等位基因特异性引物不与包含所述突变的核酸退火的温度条件。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中第二引物组的除所述等位基因特异性引物之外的引物与所述第一引物组的一个引物共同设计。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中在第一引物组中，具有与第二引物组的等位基因特异性引物相同方向的引物的浓度是其他引物浓度的1/100至1/20。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其包括基于通过离子交换色谱分离的扩增产物峰的存在或不存在来检测第二引物组的扩增产物的存在或不存在的步骤。

6.通过使用来自DNA聚合酶的核酸扩增反应的扩增产物对核酸样品中包含的突变等位基因进行定量的方法，该方法包括以下步骤：

在核酸扩增反应溶液中，其中第一引物组与第二引物组共存，其中所述第一引物组设计成在基因多态性位点侧翼，所述第二引物组包含一个或多个用于从含有突变的核酸中选择性扩增的等位基因特异性引物，

(a)在防止第二引物组的核酸扩增反应的条件下，在竞争性核酸的存在下，通过第一引物组的核酸扩增反应扩增包含突变等位基因的核酸，获得扩增产物，所述竞争性核酸具有该基因的野生型等位基因序列，并与全部或部分所述多态性位点杂交，和

(b)在获得步骤(a)的扩增产物时，在通过第一引物组进行的核酸扩增反应达到饱和阶段之前，通过在以下条件下的核酸扩增反应选择性地扩增含有突变等位基因的核酸：所述条件允许至少第二引物组以反映核酸样品中所含突变等位基因的DNA量的方式连续作用于产生的扩增产物。

7.根据权利要求6的方法，其中通过第一引物组进行的核酸扩增反应的循环数设定为15至32，其中通过第二引物进行的核酸扩增反应的循环数设定为30至60，并且其中两个反应组合并连续进行。

8.根据权利要求6或7的方法，其中第二引物组的扩增产物通过离子交换色谱分离，并且其中核酸样品中包含的突变等位基因是从扩增产物的峰面积定量的。