[发明专利]检测突变基因的方法

说明书

本发明的目的是提供一种高灵敏度地检测包含野生型等位基因的核酸样品中以低频包含的突变基因(突变等位基因)的方法和定量方法。在单反应系统中，将设计为在目的基因的突变位点侧翼的第一引物组与包含对应于该突变的ASP的第二引物组混合，可以从低频突变基因获得扩增产物，并且通过包含竞争性核酸以抑制该基因的野生型等位基因的扩增反应，选择特定的引物浓度条件，并使用第一和第二引物组控制PCR反应的循环数，可以确保定量。

技术领域

本发明涉及一种用于高灵敏度检测并定量在含有野生型等位基因的核酸样品中以低频包含的突变等位基因的方法。

背景技术

遗传突变包括遗传继承的种系突变和在单个细胞中获得的体细胞突变。据报道，作为某种基因的种系突变的单核苷酸多态性(SNP)和作为典型的体细胞突变的点突变(单核苷酸突变)与多种疾病有关，并且近年来，这种核苷酸序列的检测已被用于选择预期某种药物对其有效的患者。

例如，执行表皮生长因子受体(EGFR)基因突变测试，作为确定酪氨酸激酶抑制剂(TKI)功效的基础，酪氨酸激酶抑制剂是肺癌的治疗剂。由于通过使用痕量的癌组织标本进行该测试，并且将来源于正常组织和癌组织的野生型等位基因混合，因此需要测试具有高灵敏度和高特异性。

在EGFR基因突变中，外显子20的密码子790处的点突变(T790M，2369C->T)特别被称为对第一代和第二代TKI(如吉非替尼和阿法替尼)的耐药性突变。最近已在临床上使用了对T790M突变有效的第三代TKI(osimertinib)，并且需要对T790M突变进行测试，作为将其应用于已知具有TKI耐药性并经历肺癌复发的患者的条件。此外，需要通过频繁的再次活检来收集和检查组织标本，以免忽视由于T790M突变和肺癌复发而引起的TKI耐药性迹象；然而，高度侵入性的再次活检对患者造成沉重负担，并且在某些情况下无法进行。因此，近年来，即使从流出到血浆中的癌组织来源的无细胞DNA中检测到T790M突变，也可以开奥西替尼的处方。然而，血浆中的无细胞DNA的量非常小，并且要求突变检测方法具有比从组织样本检测所需的灵敏度更高的灵敏度。另外，需要用于捕获T790M突变量的变化的定量方法来监测肺癌的复发。

检测EGFR中的基因突变的报道方法包括实时PCR方法(非专利文献1)和MBP-QP方法(非专利文献2)，其通过结合了使用等位基因特异性引物(ASP)的ASP-PCR方法和通过Q探针的解离曲线分析而实现。这些方法的检测灵敏度约为0.1％至1％，足以从已经确认含有癌细胞的组织样本中进行检测；然而，这被认为不足以检测复发患者的低频突变。最近出现的数字PCR方法的灵敏度是这些检测方法的100倍或更高，并且能够进行定量，并且据报道，使用这种方法能够检测现有检测方法无法检测的突变，例如检测未使用TKI治疗的患者的突变(非专利文献3)。一个广泛接受的想法是，即使检测到这样的低频T790M突变时，也应根据对第一代和第二代TKI的抗性以及第三代TKI的有效性来评估突变基因的比例与药物反应之间的关系。如果明确了这种关系，则可以根据抗性突变基因的比例选择合适的药物。然而，实现高度灵敏定量的数字PCR方法操作复杂并且需要昂贵的专用设备。

上述的ASP-PCR方法是一种用于检测EGFR、RAS等的基因突变(尤其是点突变)的简单且相对灵敏的技术；但是，ASP特异性的提高对于用这种方法构建高度灵敏的突变检测系统至关重要。通常将ASP设计为3'端的1至3个碱基中的任何一个对应于基因多态性(例如单核苷酸多态性)的突变核苷酸，并进一步设计为通过在多态性位点以外的位置人工添加与靶核酸不互补的序列(错配)来确保特异性(专利文献1，专利文献2和本申请优先权日申请人的未公开专利申请(PCT/JP2017/12820))。但是，具有人为添加的错配的ASP的亲和力低于完全匹配的引物，这可能导致扩增效率降低。

对于用于检测单核苷酸突变的ASP，缩短引物长度对于确保根据单碱基的差异的特异性是有效的。另一方面，在用具有短引物长度的ASP进行扩增的情况下，必须降低PCR的退火温度，这可能引起对发生非特异性扩增的担忧。当在一个反应系统(多重PCR)中使用多个引物同时扩增多个突变时，这种非特异性扩增特别容易发生。