[发明专利]层析

说明书

本发明属于纯化特别是蛋白质纯化领域。本发明提供了用于蛋白质和其他生物分子的工业规模纯化的改进技术。更具体地，本发明涉及一种用于纯化目的化合物例如蛋白质，优选抗体或抗体片段的方法，其使用层析步骤，优选半连续层析步骤。

发明领域

本发明属于纯化特别是蛋白质纯化领域。本发明提供了用于蛋白质和其他生物分子的工业规模纯化的改进技术。更具体地，本发明涉及一种用于纯化目的化合物例如蛋白质(优选抗体或抗体片段)的方法，其使用层析步骤,优选半连续层析步骤。

发明背景

蛋白质和核酸分子的大规模经济性的纯化对于生物技术产业而言日益成为重要的问题。通常，蛋白质是通过细胞培养产生的，其使用经工程化改造以产生目的蛋白质(通过插入含有该蛋白质基因的重组质粒)的哺乳动物或细菌细胞系。由于使用的细胞系是活生物体，因此必须向它们补给含有糖、氨基酸和生长因子的复合生长培养基。必须从补给到细胞的化合物的混合物和细胞本身的副产物(进料流)中分离出目的蛋白质，达到足以用作人用治疗剂的纯度。对于意图用于人给药的蛋白质，卫生当局关于进料流中的杂质制定的标准非常高。

工业蛋白质纯化通常在非常大的规模进行。用于产生治疗性蛋白质例如抗体的商业生物反应器通常包含数百、数千甚至数万升的培养基。细胞通常生长至所需水平，该水平可以通过例如在适当的波长(例如约600nm)测量生长培养基的光密度来确定，其中光密度的增加对应于生长培养基中细胞浓度的增加。

一旦达到了期望的水平，通常就制备粗蛋白提取物。粗提取物可以通过常规技术如裂解、过滤和/或初始浓缩等来制备以产生粗提取物。来自商业生物反应器的要处理的大量培养基相应产生大量的粗提物。例如，2000升的细胞培养物通常可产生数百升体积的粗蛋白提取物，经常含有数千克的期望蛋白。

工业蛋白质合成技术中产生的大量粗蛋白提取物需要专用的纯化技术。用于纯化很少体积(通常为数十至数百毫升)的粗蛋白提取物(原料)的实验室规模技术通常很难扩大到工业水平，原因是难以防止污染、需要高效处理、对自动化的要求等。因此，已经开发了工业规模的纯化技术用于大规模纯化生物分子例如蛋白质。

经常使用层析技术来实现蛋白质纯化，例如亲和层析(其基于目的蛋白质与偶联至层析基质的特异性配体之间的可逆相互作用来分离蛋白质)；离子交换层析(其基于蛋白质的带电基团与附接到层析基质的带相反电荷的分子的非特异性静电相互作用来分离蛋白质)；置换层析(其基于蛋白质对层析基质的动态亲和力分离蛋白质)；和大小排阻层析(其基于蛋白质的大小分离蛋白质)。这些和其他用于分离生物分子的层析技术的一个共同特点是存在合适的分离基质，通常称为树脂。层析基质通常较昂贵，并且由于不可逆的污染、基质材料的降解、基质上官能团的不期望的反应等原因，使用期限有限。需要在工业蛋白质纯化中处理的大体积的粗蛋白提取物相应地需要大量层析基质。这种基质的高成本是使纯化技术的效率尽可能最大化的驱动力。

设计蛋白质纯化技术时必须考虑的另一个方面是需要从目的蛋白质中去除的杂质的性质。通常，粗蛋白提取物中所含的杂质与目的蛋白相比，具有在结合层析基质方面明显不同的特征。这种杂质通常很容易去除。其他杂质通常与目的蛋白质具有相似的结合特征。通常，这些杂质可以至少部分地与期望蛋白质从基质上共洗脱，从而观察到一定程度的重叠。因此，包含目的蛋白质和杂质的原料通常可以被认为包含三种成分：目的产物(即产物生物分子)；与层析基质的结合比目的产物弱的杂质；以及与层析基质的结合比目的产物强的杂质。

分离此类组分的传统技术依赖于分批柱层析。将原料加载到柱上，并以小级分收集柱流出液。与层析柱最弱结合的原料组分首先洗脱。因此，除了仅含有目的产物的级分外，前导级分既包含目的产物还包含与层析基质的结合不如目的产物强的杂质；而尾部级分既包含目的产物还包含与层析基质的结合比目的产物更强的杂质。由于对要用于治疗应用的蛋白质的严格纯度要求，传统上将这些“重叠级分”(即前导级分和尾部级分)丢弃，从而降低了整个纯化方法的效率。