[发明专利]使用聚合微管蛋白纯化核酸的方法和工具

说明书

本发明涉及核酸纯化领域。特别地，本发明涉及用于纯化样品中的核酸的方法和工具；其与高通量测序和诊断相容。发明人已经表明，募集到聚合微管蛋白(即微管)的核酸结合蛋白随后可以从细胞裂解液中分离。令人惊讶的是，现已发现，与不含核酸结合部分的蛋白质相比，在包含核酸结合部分和聚合微管蛋白结合部分的核酸捕获蛋白质的存在下，这些微管沉淀中发现的回收核酸的含量急剧增加；并且纯化核酸的回收本身特别有效。该纯化方法特别适合于高通量测序和/或在用于鉴定或比较一组样品中的核酸含量的诊断方法的情况下。

技术领域

本发明涉及用于纯化核酸的方法和工具；并且更具体地，涉及适用于高通量测序和诊断的纯化方法。

背景技术

分子诊断学变得日益重要。不仅已经找到了进入疾病临床诊断的途径(尤其是感染性试剂的检测、基因组突变的检测、循环肿瘤细胞的发现以及对疾病易感性的风险因素的识别)，而且在兽医、环境分析和食品测试中，也正在使用分子诊断方法。在病理学/细胞学研究所或法医问题方面的测试代表进一步的应用领域。在医疗保健方面(例如，在没有感染性试剂的情况下对血液供应进行测试)，也正在使用基因诊断法，且立法者计划在将来通过法律规范此类测试。用于临床分子诊断的方法(例如杂交或扩增技术，诸如聚合酶链反应(PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链反应(LCR)、支链DNA(bDNA)或基于核酸序列的扩增(NASBA)技术)也是基础科学研究常规程序的一部分。

特别地，通过测定组织中的基因表达，核酸分析为癌症的研究和诊断开辟了有希望的新可能性。因此，例如，微阵列系统打开了在单个反应中测定数百个甚至数千个基因表达的可能性。

例如，从样品材料开始，将纯化的核酸(即RNA或cDNA)施加到包含相应捕获寡核苷酸的芯片上，因此可以通过杂交检测样品中的核酸。另外，用于检测样品中的核酸的其他方法，例如扩增方法(诸如聚合酶链反应(PCR))，也被广泛使用。

核酸分析中的一个基本问题是样品制备。待研究的样品通常包含具有干扰的部分不溶性成分(称为碎片)的细胞或组织，这些成分可能会干扰目标核酸随后的分离和分析。这种不溶性成分特别是在从粪便/大便、血液、疣、钙化结构(骨骼)或严重坏死的组织样本中分离核酸的情况下出现。在最广泛的意义中，碎片还可包括在分离核酸期间应去除的其他可溶性成分。

用于纯化核酸的方法(尤其是在测序之前)已经在本领域有报道。

例如，磁性固相载体(诸如功能化的珠或颗粒)，已经在用于可逆结合核酸的方法中使用了数年(参见参考文献US 5705628 A)，以用于纯化所述核酸的特定目的。

另外，在对以低于核糖体RNA的含量存在的信使RNA和其他非编码RNA进行测序之前，磁性固相载体(诸如功能化的珠或颗粒)已用于从总RNA样品中去除核糖体RNA。

同样，RNA免疫沉淀测序(RIP-Seq)方法包括映射蛋白质与RNA-蛋白质复合物中的RNA结合的位点。在这种方法中，RNA-蛋白质复合物用靶向目标蛋白质的抗体免疫沉淀。然后，提取通过免疫沉淀回收的RNA分子、逆转录为cDNA、鉴定并定量。或者，在部分RNAse消化后，则通过其与蛋白质结合而被保护的RNA序列可被映射回基因组，而cDNA的深度测序可进一步提供结合RNA的单碱基分辨率(参见参考文献US2002/0004211A1，其涉及用于区分内源性细胞mRNA-蛋白质(mRNP)复合物的方法)。

仍然需要用于纯化核酸(尤其来自生物样品的核酸)的有效方法和工具，其仍可负担、可再现且与高通量测序和诊断兼容。

发明简述

根据第一目的，本发明涉及一种用于纯化样品中的核酸分子的方法，至少包括以下步骤：

a)在有效条件下使所述样品与至少一种微管蛋白和一种或多种包含核酸结合部分和聚合微管蛋白结合部分的核酸捕获蛋白接触，以与结合所述待纯化核酸的所述核酸捕获蛋白复合形成聚合微管蛋白；和