[发明专利]用于CRISPR/CAS激活系统的合成的指导RNA

权利要求书

1.合成的两部分指导RNA (gRNA)，其包含：

(a) 成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR) RNA (crRNA)；和

(b) 反式作用crRNA (tracrRNA)，

其中：

所述crRNA包含与染色体DNA中的靶序列互补的5’序列和能够与tracrRNA的一部分碱基配对的3’序列；和

所述tracrRNA包含5’四环和至少一个茎-环，并且所述5’四环和/或至少一个茎-环经修饰以含有至少一个形成发夹的RNA适体序列。

2.权利要求1的合成的两部分gRNA，其中所述至少一个形成发夹的RNA适体序列是MS2序列、PP7序列、com序列、盒B序列、组蛋白mRNA 3’序列、富含AU的元件(ARE)序列或其变体。

3.权利要求1或2的合成的两部分gRNA，其中所述至少一个形成发夹的RNA适体序列位于tracrRNA的5’四环、至少一个茎-环和/或3’末端中。

4.权利要求1-3中任一项的合成的两部分gRNA，其中所述tracrRNA的至少一个茎-环包含茎-环1、茎-环2和茎-环3，和所述至少一个形成发夹的RNA适体序列位于5’四环中和/或茎-环2中。

5.权利要求4的合成的两部分gRNA，其中所述5’四环和/或茎-环2进一步包含延伸序列。

6.权利要求5的合成的两部分gRNA，其中所述延伸序列包含约2个核苷酸至约30个核苷酸。

7.权利要求5或6的合成的两部分gRNA，其中所述crRNA进一步包含能够与tracrRNA的5’四环中的延伸序列或5’四环中的延伸序列的一部分碱基配对的序列。

8.权利要求1-7中任一项的合成的两部分gRNA，其中所述crRNA是化学合成的。

9.权利要求1-7中任一项的合成的两部分gRNA，其中所述tracrRNA是体外酶促合成的。

10.编码权利要求1的tracrRNA的核酸。

11.权利要求9的核酸，其可操作连接至被噬菌体RNA聚合酶识别的启动子序列用于体外RNA合成。

12.权利要求10的核酸，其是载体的一部分。

13.试剂盒，其包含如权利要求1-6中任一项定义的tracrRNA或如权利要求10-12中任一项定义的核酸。

14.权利要求13的试剂盒，其进一步包含至少一种如权利要求1、7或8中任一项定义的crRNA。

15.权利要求14的试剂盒，其中所述至少一种crRNA包含crRNA的库。

16.权利要求13-15中任一项的试剂盒，其进一步包含与至少一种功能结构域缔合的至少一种RNA适体结合蛋白或编码与至少一种功能结构域缔合的至少一种RNA适体结合蛋白的核酸。

17.权利要求16的试剂盒，其中所述RNA适体结合蛋白是MCP、PCP、Com、N22、SLBP或FXR1，和所述至少一种功能结构域是转录激活结构域、转录阻抑结构域、表观遗传修饰结构域、标记结构域或其组合。