[发明专利]用于CRISPR/CAS激活系统的合成的指导RNA

说明书

包含合成的两部分含适体指导RNA的组合物和使用所述合成的两部分含适体指导RNA与CRISPR/Cas激活系统的方法。

领域

本公开内容涉及包含RNA适体序列的合成的两部分指导RNA和其用途。

背景

CRISPR/Cas9协同激活介质(SAM)系统(Konermann等人, Nature, 2015, 517(7536):583-588)通过组合VP64-dCas9人工转录因子与募集另外的转录辅激活因子的适体-sgRNA提供高水平转录激活的平台。因为另外的适体序列，单一SAM-gRNA的化学合成仍有挑战。因此，使用sgRNA可限制CRISPR/Cas9 SAM系统的易用性和效率。因此，需要可容易和高效产生的与CRISPR/Cas激活系统一起使用的两部分含适体gRNA系统。

简述

在本公开内容的各个方面中，提供了合成的两部分指导RNA (gRNA)，其中每个两部分gRNA包含(a) 成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR) RNA (crRNA)和(b) 反式作用crRNA (tracrRNA)。每个crRNA包含与染色体DNA中的靶序列互补的5’序列和能够与tracrRNA的一部分碱基配对的3’序列，和每个tracrRNA包含5’四环和至少一个茎-环，和所述5’四环和/或至少一个茎-环经修饰以含有至少一个形成发夹的RNA适体序列。

一般而言，至少一个形成发夹的RNA适体序列可以是MS2序列、PP7序列、com序列、盒B (box B)序列、组蛋白mRNA 3’序列、富含AU的元件(ARE)序列或其变体，和至少一个形成发夹的RNA适体序列可位于tracrRNA的5’四环、至少一个茎-环和/或3’末端中。

在一些实施方案中，tracrRNA的至少一个茎-环包含茎-环1、茎-环2和茎-环3，和至少一个形成发夹的RNA适体序列可位于5’四环和/或茎-环2中。在一些情况下，5’四环和/或茎-环2可进一步包含延伸序列，其范围可为约2个核苷酸至约30个核苷酸。在某些实施方案中，crRNA进一步包含能够与tracrRNA的5’四环中的延伸序列或5’四环中的延伸序列的一部分碱基配对的序列。

在某些实施方案中，crRNA是化学合成的和tracrRNA是体外酶促合成的。

本文还提供了编码上述tracrRNA的核酸。

本公开内容的另一方面包括包含上文定义的tracrRNA的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒进一步包含至少一种上述crRNA。在一些重复中，所述至少一种crRNA包含crRNA分子的库。