[发明专利]用于诊断分析的改进的REP蛋白

说明书

本发明涉及一种DNA复制相关(Rep)蛋白，其包括SEQ ID NO：11或12所示的氨基酸序列；(b)SEQ ID NO：11或12的片段，其能够结合对具有SEQ ID NO：11或12的氨基酸序列的蛋白质有特异性的抗Rep抗体；或(c)氨基酸序列，其与(a)或(b)的氨基酸序列具有90％或更高的同源性，并且能够结合对具有SEQ ID NO：11或12的氨基酸序列的蛋白质有特异性的抗Rep抗体。本发明还涉及诊断MS或MS易感性的方法，以及用于这种方法的试剂盒。

本发明涉及DNA复制相关(Rep)蛋白的检测和定量，其用于诊断神经退行性疾病，诸如例如，多发性硬化(MS)。特别地，本发明涉及突变的MSBI1基因组编码的Rep蛋白。

多发性硬化(MS)的病因尚未解决。因此，需要用于MS的生物标记物，其可用于诊断MS和/或监测MS或治疗MS和/或评估MS的易感性。

多发性硬化(MS)的特征是MS病变的脱髓鞘作用，其破坏大脑和脊髓中的神经细胞。MS症状或以突然恶化(复发、加重、再发、发作)出现或随时间逐渐恶化(渐进形式)出现。脱髓鞘作用开始炎症过程，其触发T细胞并释放细胞因子和抗体。对于MS的诊断，尤其是使用了神经影像学、脑脊液分析和诱发电位。

从不同的测试材料(多发性硬化(MS)脑组织、牛血清、牛奶)中分离出了17种不同但部分相关的DNA分子谱(Funk,Gunst et al.2014,Gunst,Zur Hausen et al.2014,Lamberto,Gunst et al.2014,Whitley,Gunst et al.2014)。

在这些分离物中，从MS患者的脑组织中分离出两种与可传播的海绵状脑炎(TSE)相关分离物Sphinx 1.76(1,758bp；登录号HQ444404，(Manuelidis L.2011))密切相关的DNA分子。这些分离物是分别称为“MSBI1基因组”和“MSBI2基因组”的MSBI1.176(MSBI，多发性硬化脑分离物)(1,766bp)和MSBI2.176(1,766bp)。MSBI1,176与Sphinx 1.76的序列具有98％的核苷酸相似性。这些分离物的大开放阅读框(ORF)编码一种假定的DNA复制蛋白，它们之间具有高度相似性。另一个共同特征是存在重复子样串联重复。该重复区域的比对表明单核苷酸核心的变化。该重复子样重复可以构成Rep蛋白的结合位点。分离物的序列已以登录号LK931491(MSBI1.176)和LK931492(MSBI2.176)保藏在EMBL数据库中(Whitley C.etal.2014)，并已在WO 2016/005064中进行了比对和描述。

本发明人最近发现，野生型MSBI1基因组显示出转录的RNA的大量产生，并且MSBI1基因组编码的Rep蛋白在人细胞中表达。他们发现，野生型MSBI1和MSBI2基因组编码的Rep蛋白(MSBI1 Rep和MSBI2 Rep)代表了用于致病性筛选测定的生物标记物。作为DNA复制相关蛋白(RepB)，Rep蛋白具有DNA结合活性，并且对于启动游离体或病毒DNA分子的复制可能是必不可少的。但是，与野生型MSBI1和2基因组编码的Rep在结构上相似的Rep蛋白显示出显著的自我低聚和聚集潜能(aggregation potential)。

为了诊断筛选测定，将野生型Rep蛋白抗原MSBI1 Rep和MSBI2 Rep纯化并在变性和还原条件下保存，以最大程度地减少对该蛋白的聚集或降解作用。不幸的是，发明人观察到在非变性条件下野生型MSBI1 Rep蛋白的先前纯化确实显示出大量可见的蛋白聚集，这最明显地使得Rep蛋白不可用于亲和纯化。残留的极少量纯化的Rep蛋白在非常短的时间内(数小时)聚集，从而使该蛋白不足以用于进一步的诊断测定。这与描述了与MSBI1 Rep相当的Rep蛋白的聚集的先前的研究一致。