[发明专利]烟酰胺单核苷酸的制造方法及该方法所使用的转化体

说明书

本发明的课题在于提供生产效率优异的烟酰胺单核苷酸(NMN)的制造方法。本发明(第一发明组)涉及的NMN的制造方法包括下述工序：使烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)、磷酸核糖焦磷酸合成酶(Prs)、多磷酸激酶(Ppk)的各种酶的表达被强化而得的转化体、表达上述三种酶而得的无细胞蛋白质合成反应液、或它们的处理物与包含核糖‑5‑磷酸(R5P)、烟酰胺(NAM)、ATP及多磷酸的混合物接触。

技术领域

本发明涉及烟酰胺单核苷酸等核酸系化合物的制造方法。

背景技术

烟酰胺单核苷酸(NMN)为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的合成中间体。近年来，明确了NMN通过向NAD+的转变来控制长寿基因“Sirtuin”的活性，如果将NMN施与至小鼠则显示抗衰老作用。进一步，还报道了NMN对于糖尿病、阿尔茨海默症、心力衰竭等疾病的预防、症状的改善有效果。期待这样的NMN作为功能性食品、药品、化妆品等的成分的用途，以生产性的提高为目标，高效的制造方法的研究开发正在进行着。

专利文献1中记载了NMN的制造方法(权利要求1、13、15等)，其为将使烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)过表达了的细胞(酵母、细菌等)分离，在烟酰胺(NAM)的存在下培养该细胞。Nampt是由NAM和细胞内被生物合成的磷酸核糖焦磷酸(PRPP)来生成NMN的酶。专利文献1中还记载了为了促进PRPP的生物合成，对于上述细胞使磷酸核糖焦磷酸合成酶(Prs)进一步过表达(权利要求3等)。Prs为由核糖-5-磷酸(R5P)和ATP来生成PRPP和AMP的酶。专利文献1中，在有效利用过表达特定酶的细胞的状态下，一边用含有碳源、氮源等的培养基进行培养，一边通过生物体内的酶反应来生成NMN等目标化合物。

专利文献2中记载了使用了相对于反应生成物的感受性被减弱(即，由于难以经受利用Prs生成的PRPP带来的负反馈，因此能够增加PRPP向体系内的供给量)的Prs突变体的NAD前体合成系统(权利要求1，第0068段等)。还记载了该Prs突变体可以是在重组体中生成、并且被分离、精制而得(权利要求6等)。专利文献2中还记载了系统可以进一步包含Nampt、ATP、R5P、PRPP(权利要求10、20、21、23等)。

另一方面，非专利文献1中记载了使用核糖激酶(Rbk，该文献中被表述为RK)、Prs(同样地被表述为PPS)和次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(8B3)这三种酶，由核糖合成肌苷一磷酸(IMP)的方法。Rbk参与由核糖和ATP生成R5P和ADP的反应(i)，Prs参与由R5P和ATP生成PRPP和AMP的反应(ii)，8B3参与(iii)由PRPP和肌苷酸生成IMP和焦磷酸(PPi)的反应。上述非专利文献1记载的方法中，利用腺苷酸激酶由反应(ii)所生成的AMP来再生ADP。此外，由该被再生的ADP和反应(i)所生成的ADP，利用磷酸烯醇丙酮酸和丙酮酸激酶来再生ATP。

专利文献3中记载了ATP的制造方法，其为使作为单独能够由AMP来合成ATP的酶的多磷酸激酶(Ppk)2型与多磷酸及AMP发生反应。作为这样的多磷酸激酶2型，公开了来源于嗜热菌(细长嗜热聚球藻(Thermosynechococcus elongatus)等)的具有特定氨基酸序列的多磷酸激酶。专利文献3中进一步还记载了在利用ATP来制造物质(目标化合物)的方法中，通过同时实施上述ATP的制造方法，从而使目标化合物的合成反应与ATP的再生反应结合，由AMP再生的ATP被用于目标化合物的合成。

专利文献4中记载了将大肠杆菌在60～80℃进行加热，在大肠杆菌的细胞膜被破坏的状态下，进行ATP的再生反应的方法，其中，大肠杆菌包含来源于即使在70℃、10分钟的热处理时也不失活的嗜热菌的Ppk的基因，此外，在60～80℃时该大肠杆菌的通常的酶丧失活性并且获得多磷酸的细胞透过性。

专利文献5中记载了烟酰胺单核苷酸的制造方法，其为将NAM、ATP和核糖作为原料，在烟酰胺磷酸核糖转移酶、核糖磷酸焦磷酸激酶和核糖激酶的催化剂作用下进行反应。