[发明专利]含抗体或Fab片段和荧光团的光学显微术试剂

说明书

本发明涉及一种抗体或Fab片段，其中，轻链的N‑末端氨基酸和/或重链的N‑末端氨基酸中的至少一个氨基基团通过酰胺键，与含荧光基团A的分子结合，其中所述酰胺键构成所述分子与所述抗体或Fab之间总结合力的至少70％。

技术领域

本发明涉及免疫荧光显微术领域，尤其涉及用于该技术的新的免疫荧光探针。

背景技术

免疫荧光显微术是，通过使用经荧光分子标记的抗体(也称为免疫荧光探针)，利用抗体特异性识别并结合细胞内或细胞外的蛋白质表位，从而使组织或细胞中的特定蛋白质抗原显现出来的技术。因使目标抗原可见而著称的两种主要方法是：直接和间接免疫荧光法。在直接免疫荧光法中，使针对目标抗原且已经偶联荧光基团的抗体，与组织或细胞的切片发生反应，其中抗体与目标蛋白质特异性结合。然而，在间接免疫荧光法中，使针对抗原的特异性抗体与待分析的样品发生反应，并使用第二抗体突出显示抗原和抗体之间的结合位点，其中第二抗体与第一抗体的恒定部分结合并与荧光基团偶联。在两种情况下，被标记的样品接着使用荧光显微镜或共聚焦显微镜来进行观察。特别是，用特定波长的光束照射样品，该特定波长的光束会被荧光基团吸收，重新发射出比被吸收的光的波长长的光。由于使用滤光片，而使激发光与发射光分离开，从而在抗原处显现出荧光信号。

与电子显微术相比，该技术的突出优点在于可在离体系统中使用。

免疫荧光法中常用的第一抗体或第二抗体经由赖氨酸残基或半胱氨酸侧链的氨基或巯基，与荧光基团偶联。然而，与赖氨酸残基结合(其是最广泛使用的技术)无法控制与抗体结合的荧光基团分子的确切位置和数量，最终得到经标记的抗体的异质混合物(Wanget al,Protein Sci 2005,14:2436)。此外，标记抗原结合位点附近的赖氨酸残基，可能导致抗原结合位点出现空间阻滞，从而丧失抗体结合能力。

在标记抗体，尤其是标记单克隆抗体时遇到的另一个问题是，荧光基团与抗体的疏水部分非特异性结合。因此，当经标记的抗体用于组织或细胞的显微分析技术时，非特异性结合被水解，荧光基团在孵育液中扩散，产生背景信号，导致特异性丧失。

为了克服这些缺点，通过在抗体的C-末端引入含游离巯基的半胱氨酸，开发出了特定位点标记技术，其不管怎样都与抗原结合位点相距一定的距离。

在已知的标记技术中，工作pH在控制琥珀酰亚胺酯与抗体上存在的末端氨基偶联的选择性中，起着关键作用。

具体来讲，使蛋白质中存在的氨基以质子化惰性形式和去质子化反应形式等分的pH值，在数值上对应于相对值pK_n。在该pH值，质子化/去质子化形式两者处于快速动态平衡的状态下。

在这一方面，相对于赖氨酸残基的氨基，目前正在研究使末端氨基酰化的方法，以提高偶联选择性。

如前所述，抗体中存在的氨基可分为两种不同的类型：末端基团(仅两个)，和赖氨酸的多个ε-氨基。ε-氨基端基的pK值通常在7.5和13之间，而相应的端基的平均值约为7.5。

pH值较高时，大多数氨基被不加选择地去质子化，从而具有反应性。

在这种情况下，虽然反应产率极高，但对于末端氨基的偶联选择性却大大降低。

面对这些情况，对于末端氨基的偶联选择性严重受限，而抗体侧链上存在的赖氨酸残基发生不受控制地偶联的可能性较高。

就这一点而言，在赖氨酸的ε-氨基水平上不需要、但确实存在于待衍生蛋白质中的偶联非常多。

这就容易理解为什么到目前为止仅部分解决了这一问题。事实上，特别需要根据抗体反应期间的pH值，对可偶联的氨基进行实际测量，以确保较高的偶联特异性。

使偶联针对特定类型的氨基，尤其是末端基团，同时区分掉另一种类型，即赖氨酸的ε-氨基，意味着提高反应选择性，但这并不是容易解决的问题。