[发明专利]用于提高碱基编辑精度的融合蛋白

说明书

本发明提供了包含胞苷和无催化活性形式的毛螺旋菌(Lachnospiraceae bacterium)Cpf1(LbCpf1)的碱基编辑器。与基于Cas9的碱基编辑器相比，该新的碱基编辑器大大提高了编辑效率和保真度，并且具有不同的编辑窗口。

背景技术

可用于从遗传学角度操作细胞和活生物体基因组的基因组编辑在生命科学研究、生物技术、农业技术发展以及药物和临床开发中具有广泛的应用价值。例如，基因组编辑可用于纠正遗传疾病中的驱动突变，从而完全治愈活生物体中的这些疾病。CRISPR/Cas(成簇的规律间隔的短回文重复序列/CRISPR相关蛋白)系统已成为最强大的基因组编辑工具，得益于其无与伦比的编辑效率、便利性以及在生物体中的潜在应用前景。由向导RNA(gRNA)引导Cas核酸酶，使其可以在各种细胞(细胞系和源自活生物体的细胞)的靶基因组位点产生DNA双链断裂(DSB)。然后通过内源性DNA修复系统修复这些DSB，可将其用于执行所需的基因组编辑。

通常，DSB可以激活两种主要的DNA修复途径，即非同源末端连接(NHEJ)和同源定向修复(HDR)。NHEJ可以在DSB周围的基因组DNA区域中引入随机插入/缺失(indels)，从而导致开放阅读框(ORF)移位并最终导致基因失活。相反地，当触发HDR时，靶位点的基因组DNA序列可以通过同源重组机制被外源供体DNA模板序列所取代，从而可以纠正基因突变。

近期发明了将CRISPR/Cas系统与APOBEC(载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样)胞苷脱氨酶家族整合的碱基编辑器(BE)，该编辑器极大地提高了CRISPR/Cas9介导的基因纠正的效率。通过与Cas9切口酶(nCas9)融合，大鼠APOBEC1(rA1)的胞嘧啶(C)脱氨基活性可以被定向到基因组中的靶碱基，并在这些碱基处催化C转化为胸腺嘧啶(T)的过程。

但是，在当前最活跃的碱基编辑器中，依赖于Cas9切口酶作为脱氨酶融合伴侣，会导致不必要的插入/缺失和非C到T的碱基取代的频率增加，并将编辑限制在富含G/C的前间区序列邻近基序(PAM)序列。

发明概述

在一些实施方案中，本公开提供了可用于基因组编辑的碱基编辑器，其将无催化活性的毛螺旋菌(Lachnospiraceae bacterium)Cpf1(dLbCpf1)与胞苷脱氨酶进行组合。这样的碱基编辑器识别人类细胞中富含T的PAM序列，并且以高的效率将C转换为T，同时插入/缺失、非C到T取代和脱靶编辑的水平低。这些都是与基于Cas9的碱基编辑器相比的重大改进。此外，除了APOBEC1(A1)之外，当LbCpf1与APOBEC3(A3或APOBEC3A)融合时，还可以取得更高的编辑效率。除了大大提高编辑效率和精度外，基于LbCpf1的碱基编辑器还具有与基于Cas9的碱基编辑器不同的编辑窗口。本发明中另一个有趣的发现是，游离的尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂(UGI)结构域的存在可以进一步提高碱基编辑的效率和保真度。

因此，本公开的一个实施方案提供了包含第一片段和第二片段的融合蛋白，所述第一片段包含胞苷脱氨酶，所述第二片段包含无催化活性的毛螺旋菌(Lachnospiraceaebacterium)Cpf1(dLbCpf1)。

在一些实施方案中，胞苷脱氨酶是载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样(APOBEC)蛋白。在一些实施方案中，APOBEC蛋白选自由APOBEC1、APOBEC2、APOBEC3A、APOBEC3B、APOBEC3C、APOBEC3D、APOBEC3F、APOBEC3G、APOBEC3H、APOBEC4和活化诱导的(胞苷)脱氨酶组成的群组。在一个实施方案中，APOBEC蛋白是APOBEC1。在一个实施方案中，APOBEC1蛋白包含W90Y或R126E突变，或其组合。在一些实施方案中，APOBEC蛋白是APOBEC3A。在一些实施方案中，APOBEC3A蛋白具有一种或多种选自W104A、Y130F、D131Y、D31E和/或Y132D突变的突变；组合突变的例子包括Y130F-D131E-Y132D、Y130F-D131Y-Y132D。