[发明专利]用于高通量测序的快速文库构建

说明书

本发明描述了用于高通量多核苷酸测序应用例如下一代测序(NGS)应用的构建文库的快速方法，该方法能够在单个反应管中进行。寡核苷酸探针在其5'或3'末端或两者上包含化学活性基团，以在其与绽裂模板片段的单链末端杂交后促进其5'或3'末端或两者的切割。探针末端的切割露出了杂交片段末端的单链区域。将对这些末端具有特异性的接头与杂交的探针/模板片段连接，并将平末端片段与杂交探针/模板片段的平末端(如果存在的话)连接，以生成所述文库的接头连接片段。

技术领域

本发明的领域涉及用于高通量多核苷酸测序的测序文库的构建。

背景技术

高通量筛选可以通过同时检测数百万个小尺寸范围(100-800bp)的DNA分子来快速确定DNA聚合物的核苷酸序列。短读长测序的局限性在于，即使通过最佳管道(pipeline)，基因组DNA随机断裂成数百万个非常小的片段也会导致计算组装错误。重复区域和复杂的重排和复制，大规模插入或删除通常被错误地包含或缺少。最常用的高通量测序平台在时间和试剂方面都是资源密集型的，而这限制了现有测序方法的能力，例如用于从头进行基因组组装的下一代测序(NGS)方法以及校正在大的基因组尺寸的生物中尤为普遍的重排、复制或插入的基因组分配。但是，通过开发将构建测序文库的多个步骤整合到单个反应管中的方法，可以显著改善与高通量测序方法相关的时间和试剂成本。本文描述了这种改进。

发明内容

本发明涉及用于高通量核苷酸测序方法例如下一代测序(NGS)应用的文库的构建。根据本发明的方法构建的文库含有寡核苷酸探针杂交的模板序列片段的测序接头连接的双链体。本发明的探针可在其5'或3'末端或两者上包含化学活性基团，以在其杂交后促进其5'或3'末端或两者的切割，从而显示杂交片段末端的单链区域。将对这些末端具有特异性的接头和杂交的探针/模板片段连接，并将平末端片段与杂交的探针/模板片段的平末端(如果存在的话)连接，以生成文库的接头连接的片段。本发明用于产生测序文库的方法可以在单个反应管中以相对较少的步骤进行，并且并入到用于制备测序文库的试剂盒中是理想的。

附图说明

图1显示了用于NGS的文库的构建原理图。纯化的DNA在小于12分钟的时间内被破碎，并直接用于文库构建。文库构建遵循独特的方法来生成DNA末端，该DNA末端源自用于接头连接的初始DNA模板。文库构建花了不到13分钟，并且可以直接用于PCR反应。文库构建不需要纯化步骤，尽管可能需要使用最后的磁珠纯化步骤来清理PCR步骤之后文库产物的制备或尺寸选择。在单管中执行简单的三步路线。

图2A显示了在37℃下DNA破碎时间的优化。将50ng高分子量纯化的大肠杆菌DNA用于酶促反应，孵育时间：5分钟(泳道B)；5.5分钟(泳道C)；6分钟(泳道D)；6.5分钟(泳道E)。破碎产物在2％TBE琼脂糖凝胶上以100bp的阶梯进行电泳(泳道A)。

图2B显示了在37℃下DNA破碎时间的优化。将50ng高分子量纯化的大肠杆菌DNA用于酶促反应，孵育时间：6.5分钟(泳道B)；6.75分钟(泳道C)；7分钟(泳道D)；7.25分钟(泳道E)。破碎产物在2％TBE琼脂糖凝胶上以100bp的阶梯进行电泳(泳道A)。

图2C显示了在42℃下3分钟和4分钟的DNA破碎时间的优化。将50ng高分子量纯化的大肠杆菌DNA用于酶促反应，孵育时间：在0.1mM EDTA中3分钟(泳道B和C)或4分钟(泳道G和H)；在1mM EDTA中3分钟(泳道D和E)或4分钟(泳道I和J)。破碎产物在2％TBE琼脂糖凝胶上以100bp的阶梯进行电泳(泳道A、F和K)。

图2D显示在42℃下5分钟的DNA破碎时间优化。将50ng高分子量纯化的大肠杆菌DNA用于酶促反应，孵育时间5分钟，DNA储存在0.1mM EDTA(泳道B和C)或1mM EDTA(泳道D和E)中。破碎产物在2％TBE琼脂糖凝胶上以100bp的阶梯进行电泳(泳道A和F)。