[发明专利]拉曼成像技术测定抗生素敏感性的方法

说明书

本发明公开了一种通过受激拉曼散射显微镜测定抗生素敏感性的方法。该方法通过成像设备采集细菌样本的激光信号并对细菌样本的新陈代谢活动进行成像。为了确定细菌对某些抗生素的敏感性，可以用抗生素对样本处理后进行成像。

技术领域

本发明涉及一种活细菌代谢活性的检测方法，具体涉及一种通过超光谱受激拉曼散射显微镜检测抗生素敏感性的方法。

背景技术

广泛使用和滥用抗生素来对抗各种细菌感染已经引起耐药菌数量的增加。因此，对于特定的传染病而言，通过抗生素敏感性检测(AST)分析特定细菌的抗生素反应显得尤为重要。根据细菌种类的不同，常规的AST通常利用琼脂平板和肉汤稀释法进行细菌培养，一般最少需要16-24小时。正在开发的新技术虽然能进行快速检测，但仅适用于特定细菌或需要耗时的样品富集，具有一定的限制性。

拉曼光谱法，是一种用于测量分子振动的非标定量技术，已经应用于细菌AST的快速检测。拉曼峰在指纹领域或重水D₂O代谢吸收中已经作为一种生物标记，以表征细菌对对抗生素治疗的反应。然而，由于横截面积较小，拉曼光谱产生的信号较弱，因此需要大量的样本或者每个细胞需要较长的整合时间。利用金属胶体或粗糙金属表面，拉曼信号可以通过表面增强拉曼光谱(SERS)进行增强，随着抗生素治疗的改变，SERS已经被应用于以拉曼峰为依据的AST快速检测，但SERS需要底物且信号变化较大，无法实际应用。

相干拉曼散射显微镜包括相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)和受激拉曼散射(SRS)显微镜，与自发拉曼散射相比，信号得到显著改善。与CARS不同，SRS显微镜不具有非共振背景，已应用于细胞，组织和模型生物的代谢成像方面。但SRS并非完全没有背景。超光谱受激拉曼散射(SRS)可以在每一个像素处记录光谱，用以区别来自于背景的SRS信号，包括由于非线性吸收和交叉相位调制。

对单一细菌的代谢活动成像技术仍然具有很高的挑战性。细菌的大小(直径约为1μm)比哺乳动物细胞(约10μm)小的多，接近CARS或SRS显微镜的空间分辨率。此外，C-D拉曼信号比C-H信号弱很多，因此需要一种改进的AST方法。优选地，这种方法不需要延长样品富集时间，并且在单各细胞水平上适用于各种细菌。

发明内容

一方面，本发明涉及一种适用于所有细菌的快速的抗生素敏感性检测(AST)方法。

另一方面，本发明涉及一种利用超光谱受激拉曼散射(SRS)成像技术在单一细胞水平上监测细菌中葡萄糖-d7代谢活性的方法。

另一方面，本发明涉及一种适用于所有细菌的快速的(AST)方法，利用超光谱受激拉曼散射(SRS)成像技术在单个细胞水平上监测活细菌中葡萄糖-d7代谢活性。这种方法可以使用类似地其他的营养源，例如D₂O。万古霉素敏感性(VSE)和耐药性(VRE)肠球菌可以作为模型，利用SRS成像在单个细胞水平上可以检测到细菌以及定量监测到它们的代谢活性，也可以检测到对抗生素治疗的代谢反应，从而在30分钟内确定细菌敏感性和最低抑菌浓度(MIC)。同样，成像方法还可以应用到具有不同抑菌或杀菌机制的其他抗生素上。由于葡萄糖是细菌生产的常见碳源，因此我们可以合理预测这种方法可以适用于多种细菌。

另一方面，本发明涉及一种样品制备方法，适用于改良的细菌培养以及使信噪比最大化的成像设置，以获得更加一致的图像处理过程。