[发明专利]利用疏水相互作用分离细胞外囊泡的方法

说明书

本发明涉及一种分离细胞外囊泡的方法，具体涉及一种利用细胞外囊泡的疏水性分离细胞外囊泡的方法，以及使用所述方法分离的细胞外囊泡。当使用所述方法时，本发明所述分离细胞外囊泡的方法能够从包括血液和尿液的各种动物体液或包括癌症组织在内的各种组织中分离出不含用常规方法难以消除的脂蛋白污染的细胞外囊泡。所述方法可以解决脂蛋白污染引起的常规问题，并且有望成为一项重要的技术，对使用从各种动物体液或组织中分离的细胞外囊泡的各种研究产生重大影响，如特征和功能研究、多组学研究、新型生物标志物的挖掘、诊断和治疗等。

技术领域

本发明涉及一种分离细胞外囊泡的方法，具体涉及一种利用细胞外囊泡的疏水性分离细胞外囊泡的方法，并且涉及一种通过所述方法分离的不含包括脂蛋白在内的杂质的细胞外囊泡。

背景技术

细胞外囊泡是纳米级的颗粒(20-100,000nm)，可从地球上的所有细胞中自然释放，并具有源于细胞的脂质双层膜结构。对于动物而言，细胞外囊泡被发现存在于体液(例如血液、唾液、泪液、鼻粘液、汗液、尿液、粪便、脑脊液(CSF)、腹水、羊水、支气管肺泡灌洗液、胸腔积液、精液、乳汁等)以及各种肿瘤或正常组织中。

细胞外囊泡含有来自分泌细胞(母细胞)的各种生理活性物质(例如蛋白质、脂质、氨基酸、RNA等)，故其可以体现母细胞的生理和病理特征。另外，已经发现细胞外囊泡可作为载体与其他细胞和组织结合，以将生理活性物质从母细胞转移至受体细胞和组织，从而执行各种生理和病理功能。因此，细胞外囊泡的成分和功能正在不断被研究，以期利用细胞外囊泡作为诊断和治疗各种疾病的新方法。

一般而言，已经有许多技术被用于分离细胞外囊泡，包括超速离心、密度梯度离心、超声裂解、分子筛、聚合物沉淀、盐沉淀、有机溶剂沉淀、离子交换层析、亲和层析和双液相体系。其中，超速离心是应用最广泛的。该技术可有效地从相对较小的材料中分离出纳米颗粒，因此可用于从各种材料(包括样品中的可溶性蛋白质)中分离细胞外囊泡。

关于细胞外囊泡的利用，业界正在进行研究：分析从体外培养的细胞分离的细胞外囊泡的成分以挖掘新的生物标志物，以及对包括血液或各种组织(包括癌症组织)的动物体液中分离的细胞外囊泡的成分(例如蛋白质、核酸等)进行定量比较，从而在包括诊断、预后评估或疾病治疗在内的许多方面利用细胞外囊泡。

特别地，对利用源自包括血液(血清和血浆)和尿液的各种动物体液以及癌组织在内的各种组织的细胞外囊泡进行诊断和治疗的需求很大。然而，因为存在于动物体液或组织中的纳米颗粒包括各种形式的脂蛋白以及细胞外囊泡，所以难以通过常规的细胞外囊泡分离技术选择性地单独分离细胞外囊泡。

脂蛋白是运输胆固醇和甘油三酸酯的重要因子，胆固醇和甘油三酸酯是细胞构造必不可少的膜的基础。另外，已知脂蛋白可以用作在血液中运输细胞外核酸的载体(NatCell Biol,2011,Vicker et al.,ISSN:1476-4679)，这点非常类似于在血液内运输细胞外核酸的细胞外囊泡。根据大小(nm)和密度(g/mL)，脂蛋白分为以下纳米颗粒：高密度脂蛋白(HDL；5-15nm，1.063g/mL)，低密度脂蛋白(LDL；18-28)nm，1.019-1.063g/mL)，中密度脂蛋白(IDL；25-50nm，1.006-1.019g/mL)，极低密度脂蛋白(VLDL；30-80nm，0.950-1.006g/mL)和乳糜微粒(100-1000nm，约0.95g/mL)。

血液中的这种细胞外囊泡和脂蛋白除了转运细胞外核酸的功能外，在大小和密度等各个方面都彼此相似，因此难以选择性地分离两者(Biochem Biophys Res Commun,2009,Looze et al.,ISSN:1090-2104；J Extracell Vesicles,2014,Yuana et al.,ISSN:2001-3078；Sci Rep,2016,Sodar et al.,ISSN:2045-2322)。