[发明专利]用于增加芽胞杆菌属中蛋白质产生的经修饰的5′-非翻译区(UTR)序列

说明书

本公开总体上是能够产生增加量的工业相关目的蛋白的经修饰的芽孢杆菌属菌株及其宿主细胞。本公开的其他实施例涉及分离的多核苷酸、其载体、其DNA(表达)构建体、经修饰的芽孢杆菌属(子代)细胞、以及制造和使用它们的方法，所述分离的多核苷酸包含经修饰的枯草芽孢杆菌aprE 5′‑非翻译区(5′‑UTR)核酸序列。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2017年9月13日提交的美国临时专利号62/558304的权益，将该临时专利通过引用以其全文特此并入。

技术领域

本公开总体上涉及细菌学、微生物学、遗传学、分子生物学、酶学、工业蛋白质生产等领域。更特别地，本公开的某些实施例涉及能够产生增加量的工业相关目的蛋白的经修饰的芽孢杆菌属(Bacillus)菌株及其宿主细胞。本公开的其他实施例涉及分离的多核苷酸、其载体、其DNA(表达)构建体、经修饰的芽孢杆菌属(子代)细胞、以及制造和使用它们的方法，所述分离的多核苷酸包含经修饰的枯草芽孢杆菌aprE 5′-非翻译区(5′-UTR)核酸序列。

序列表的引用

命名为“20180823_NB41250WOPCT_SequenceListing_ST25.txt”的文本文件序列表的电子提交的内容创建于2018年8月23日，并且大小为38KB，将其通过引用以其全文特此并入。

背景技术

革兰氏阳性细菌如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)和解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)等由于其优异的发酵特性和高产率(例如，高达25克/升培养物；Van Dijl和Hecker,2013年)经常被用作用于产生工业相关蛋白质的微生物工厂。例如，枯草芽孢杆菌因其产生食品、纺织品、洗衣、医疗器械清洁、制药工业等所必需的α-淀粉酶(Jensen等人,2000；Raul等人,2014)和蛋白酶(Brode等人,1996)而为人熟知(Westers等人,2004)。由于这些非致病性革兰氏阳性细菌产生完全不含毒性副产物(例如脂多糖；LPS，也称为内毒素)的蛋白质，因此它们已经获得了欧洲食品安全局的“安全资格认定”(QPS)状态，并且其许多产品获得了美国食品和药品管理局的“通常认为安全”(GRAS)状态(Olempska-Beer等人,2006；Earl等人,2008；Caspers等人,2010)。

因此，微生物宿主细胞中蛋白质(例如，酶、抗体、受体等)的产生在生物技术领域中是特别有意义的。同样，用于产生和分泌一种或多种目的蛋白的芽孢杆菌属宿主细胞的优化具有高度相关性，特别是在如下工业生物技术环境中，其中当蛋白质以大的工业产量生产时所述蛋白质产率的微小改善具有重大意义。更特别地，地衣芽孢杆菌是具有高工业重要性的芽孢杆菌属物种宿主细胞，因此，对于构建新的和改善的地衣芽孢杆菌产生菌株，高度希望具有遗传修饰和工程化地衣芽孢杆菌宿主细胞以获得增强的/增加的蛋白质表达/产生的能力。

因此，本文所示出的公开涉及对于获得和构建具有增加的蛋白质产生能力等的芽孢杆菌属宿主细胞(例如蛋白质产生宿主细胞、细胞工厂)的高度希望和未满足的需求。

发明内容

本公开总体上涉及能够产生增加量的工业相关目的蛋白的经修饰的芽孢杆菌属菌株及其宿主细胞。更特别地，本公开的某些实施例涉及分离的多核苷酸，其包含源自野生型枯草芽孢杆菌aprE5′-非翻译区(WT-5′-UTR)核酸序列SEQ ID NO:1的经修饰的枯草芽孢杆菌aprE 5′-非翻译区(mod-5′-UTR)核酸序列。在某些实施例中，所述mod-5′-UTR包含SEQID NO:2。在其他实施例中，所述mod-5′-UTR进一步包含位于所述mod-5′-UTR的5′并有效地连接到所述mod-5′-UTR的上游(5′)启动子区核酸序列。