[发明专利]利用阳离子分离细胞外囊泡的方法

说明书

本发明涉及一种利用阳离子分离细胞外囊泡的方法，具体地涉及一种利用细胞外囊泡与阳离子之间的亲和力从各种样品中分离细胞外囊泡的方法。本发明所述分离细胞外囊泡的方法不需要昂贵的设备，在应用时可以不考虑样品的量，并且具有能够在有效分离细胞外囊泡的同时维持其形状或特性的优点。此外，本发明所述的方法可以同现有的分离方法结合以最大化细胞外囊泡的分离效率，并且可以应用于疾病诊断、疾病治疗和利用分离的细胞外囊泡的多组学研究以及对细胞外囊泡特性的研究之中。

技术领域

本发明涉及一种利用阳离子分离细胞外囊泡的方法，具体涉及一种利用细胞外囊泡对各种类型阳离子的亲和力从各种样品中分离细胞外囊泡的方法。

背景技术

细胞外囊泡是纳米尺寸的囊泡，其通过普遍的细胞机制，由从人到细菌的所有活生物或细胞自然释放。源于真核细胞的细胞外囊泡参与红细胞的分化、免疫应答的调节等，特别是被揭示出在癌细胞微环境中，对癌症的发展、转移或血管生成起重要作用。因此，在包括癌症的各种疾病中，细胞外囊泡作为诊断标签的应用受到了广泛关注。

与真核细胞的细胞外囊泡类似，原核细胞分泌的细胞外囊泡含有原核细胞的成分，不仅会引起全身性炎症，还会因其进入人体的途径而引起急性肺部炎症，据报道可在局部皮肤组织中诱导慢性炎症反应从而在皮肤中引起特应性皮炎，该皮炎是现代人的代表性疾病之一。由于源于细菌的细胞外囊泡与人体内的癌发生之间的相关性已被发现，因此源于原核细胞的细胞外囊泡也受到了广泛关注。

细胞外囊泡的最主要功能之一是其在细胞间信息交换机制中起重要作用。因此，细胞外囊泡的成分在基础研究和医学领域也备受关注。

细胞外囊泡是体内或体外各种类型的细胞分泌的生物纳米颗粒，其存在于体液中，例如血液、尿液、唾液和泪液，其包括来源于细胞的脂质双分子层，并且是具有20-10,000nm范围内的各种尺寸的膜结构囊泡。

细胞外囊泡与其他细胞和组织结合以充当转运载体，其携带细胞内物质(例如膜成分、蛋白质和RNA)，因此含有分泌该细胞外囊泡的原始细胞(母细胞)的蛋白质、脂质、氨基酸、RNA等物质。因此，细胞外囊泡是了解母细胞生理和病理特征的重要基础。除此之外，已知细胞外囊泡中所含的核酸、生长激素、蛋白质等受到细胞膜型磷脂的保护，故与可溶形式的生长因子和细胞因子相比，可以更稳定地发挥功能。相应地，细胞外囊泡的重要性越来越高，并且细胞外囊泡中包含的物质经分析后，被期望具有多种用途，包括疾病的诊断和治疗。

细胞外囊泡很小，具有纳米水平的尺寸，并且除了细胞外囊泡之外，在体液、细胞培养物等中还存在许多其他物质。因此，从样品(例如体液和细胞培养物)中分离细胞外囊泡对于分析细胞外囊泡非常重要，相当于所有用到细胞外囊泡的领域里最核心的技术之一。

近年来，已经在疾病诊断中从各种角度发展了无创液体活检的应用。另外，业界已经努力通过利用活组织或体液中的细胞外囊泡来探索用于疾病诊断的新标签，并且通过使用相应标签来进行诊断。这些努力的潜在问题在于细胞外囊泡从活组织或体液中的分离，常规的从体液中纯化细胞外囊泡方法由于产量的相对有限和高复杂性导致其几乎是不可行的。因此，迫切需要一种新的有效分离方法，该方法应不同于分离细胞外囊泡的常规方法。

用于分离细胞外囊泡的现有技术是超速离心、尺寸排阻、免疫亲和分离、微流体芯片或使用聚合物的沉淀，其中最广泛地使用是超速离心。然而，超速离心分离细胞外囊泡的方法具有局限性，例如由于步骤复杂而耗费大量劳力和时间、需要昂贵的设备并且产率低，因此这种分离方式在医药产品的纯化中的应用非常受限，因其需要大量细胞外囊泡，而该限制同样体现在需要通过仅仅使用少量样品即可快速获得结果的临床诊断中。

分离物质中最有效的方法之一是，通过对目标物质的选择性结合，在复杂的环境中逐步去除污染物，同时在分离目标物质的过程中不会损失目标物质。然而，对于细胞外囊泡，具有这种选择性结合特性的材料的例子限于某些抗体或蛋白质配体。使用这些抗体或蛋白质进行细胞外囊泡分离的方法效率低下，难以高效地开发抗体和蛋白质配体，并且成本高，故非常受限。