[发明专利]数字化亲和连接试验

权利要求书

1.检测样品中分析物的方法，所述方法包括：

使样品接触与固相载体连接的第一亲和剂，其中第一亲和剂与靶标(如存在)特异性结合，从而形成与第一亲和剂结合的靶标；

基于固相载体的存在与否，将与第一亲和剂结合的靶标与样品中未结合的物质分离，从而产生分离的样品，其包含与第一亲和剂结合的靶标；

使分离的样品与包含第一标记物的第二亲和剂以及包含第二标记物的第三亲和剂接触，其中第二和第三亲和剂特异性结合于靶标，从而形成靶标-标记的亲和剂复合物；

基于固相载体的存在与否，将靶标-标记的亲和剂复合物与未复合的第二和第三亲和剂分离，从而形成分离的靶标-标记的亲和剂复合物；

将至少分离的靶标-标记的亲和剂复合物分到多个分区内；和

通过检测至少同一个分区内第一和第二标记物的存在检测靶标在样品中的存在。

2.如权利要求1所述的方法，其中第一标记物是第一核酸标记物，第二标记物是第二核酸标记物。

3.如权利要求2所述的方法，其中在分区后扩增第一和第二核酸标记物。

4.如权利要求3所述方法，其中第一和第二核酸标记物各自用嵌入染料或选自TAQMAN^TM探针、SCORPION^TM探针、ECLIPSE^TM探针、分子信标探针、双链探针、双重杂交探针或双淬灭探针的DNA探针检测。

5.如权利要求4所述的方法，其中用同一DNA探针或嵌入染料的不同信号水平检测第一和第二核酸标记物。

6.如权利要求1所述的方法，其中第一标记物和第二标记物各自与链霉亲和素连接，第二和第三亲和剂生物素化，和其中在方法的第一步之前，第一和第二链霉亲和素连接的标记物与生物素化的第一和第二亲和剂各自通过链霉亲和素-生物素相互作用偶联。

7.如权利要求1所述的方法，其中第一亲和剂生物素化，固相载体与链霉亲和素连接，其中在方法的第一步前，链霉亲和素连接的固相载体通过链霉亲和素-生物素相互作用与生物素化的第一亲和剂连接。

8.如权利要求1-7任一所述的方法，其中第一标记物产生第一信号，第二标记物产生第二信号，第一信号和第二信号可分辨。

9.如权利要求1-8任一所述的方法，其中固相载体或多个固相载体选自磁珠、非磁性珠、或反应容器表面。

10.如权利要求1所述的方法，其中固相载体或多个固相载体包括磁珠，靶标-标记的亲和剂复合物与样品中未复合的组分用磁铁通过吸引靶标-标记的亲和剂复合物中与第一亲和剂连接的磁珠而分离。

11.任何前述权利要求任一所述的方法，其中靶标选自蛋白质、蛋白质聚集物、和蛋白质寡聚物。

12.如权利要求1-10任一所述的方法，其中靶标是两种或多种相互作用蛋白的复合物，而第二和第三亲和剂各自与复合物中的相互作用蛋白之一结合，该方法还包括计算相互作用伴侣的结合亲和力(KD)。

13.如先前权利要求任一所述的方法，其中第一、第二和第三亲和剂中的每一种与靶标上的不同表位特异性结合。

14.如前权利要求任一所述的方法，其中第一、第二和第三亲和剂各自选自抗体、抗体片段和核酸适体。

15.如权利要求14所述的方法，其中抗体是单克隆抗体和/或多克隆抗体。

16.如前权利要求任一所述的方法，还包括确定同时包含第一和第二标记物的分区数量，从而定量靶标。