[发明专利]一种检测样品中微生物的方法

说明书

本发明提供了一种检测样品中微生物的方法，所述方法包括：a)利用过滤器过滤样品以捕获样品中存在的任何微生物；b)处理过滤器以从捕获的微生物中释放基因组物质或DNA；c)扩增从捕获的微生物中释放的基因组物质或DNA；d)鉴定基因组物质或DNA的特定区域，以确定任何捕获的微生物的存在、鉴定其物种或量化其大致数量。

技术领域

本发明涉及一种检测样品中微生物的方法。

背景技术

在制药行业内，必须对所有产品进行无菌测试，以确保患者安全。MHRA准则是指使用基于肉汤的生长模拟来实现无菌、模拟测试和验证测试。在将产品投放市场之前，使用富含营养的肉汤如胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)来确定产品的无菌性。当在合适的温度下孵育时，这些肉汤为许多微生物的生长提供了合适的条件。因此，肉汤中微生物的生长是受污染产品的标志，并通过视觉方法确定肉汤14天后的浊度或颜色变化(一些案例中)来评估。从取样后满14天，该产品就可以在市场上销售，有时甚至可以给患者施用。当肉汤被认定为混浊时，会对其潜在来源进行广泛的调查，这通常会导致被测产品的召回和销毁。

这种基于肉汤的测试不仅应用于制药行业，还可应用但不限于在食品、供水和诊断行业。

尽管使用营养肉汤的前提是合乎逻辑的，但是本发明人已经发现其应用具有以下局限性，这些局限性为：1)由于某些微生物生长缓慢，测试可能需要长达14天的时间；2)浊度的识别具有一定的主观性，因为它取决于肉汤“观测者”的经验、技能和知识来识别溶液的浊度；3)由于测试需要一定的孵育时间，因此在检测到污染之前可能已给患者使用了受污染的产品，从而潜在地导致感染和死亡；(4)并非所有微生物都能在推荐的肉汤中生长，从而可能产生假阴性结果。

在最近的事故中，上述局限性导致了英国三个婴儿的死亡，本发明人开发了一种替代检测，该检测通过提供一种当日确定产品污染的方法来克服当前监管标准中的限制。

发明概述

本发明的第一方面提供了一种检测样品中微生物的方法，所述方法包括：

a)利用过滤器过滤样品以捕获样品中存在的任何微生物；

b)处理过滤器以从捕获的微生物中释放基因组物质或DNA；

c)扩增从捕获的微生物中释放的基因组物质或DNA；

d)鉴定基因组物质或DNA的特定区域，以确定任何捕获的微生物的存在、鉴定其物种或量化其大致数量；

其中步骤c)在过滤器上进行。

因此，本发明提供了能够在数小时内鉴定出单个微生物(例如单个细菌或真菌细胞)存在的DNA扩增技术。本发明的方法不需要培养的步骤。DNA扩增的快速特性使用户可以在产品投放市场之前获得结果，从而在产品投放时提供更强的保证，即投放的产品符合监管机构严格的生物负荷要求。

DNA扩增的使用还大大减少了结果读取的主观性。DNA的存在与否可以通过不同的方式进行检测，其中许多方法都需要使用者进行最低限度的解读。例如，使用qPCR检查特定DNA序列的存在时，如果序列存在，则提供一种容易区分且机器可读的荧光读数。尤其是，DNA分析技术可以提供与微生物源无关的相同类型的读数。因此，用户仅需针对一种类型的读数进行培训。这与利用生长肉汤产生鲜明对比，在生长肉汤中，不同的微生物培养物可能生长的程度不同并且其外观差异较大。在某些情况下，肉汤中的情况难以被解读。

本发明的技术不限于仅检测能够在任何给定肉汤中生长的微生物。可以使用适用于任何基因组物质或DNA的可靠且可再现的方法进行DNA扩增，而不管基因组物质或DNA源自的微生物为何。这对于检测仅在非常特定条件下繁殖的微生物(例如需要合适宿主细胞的存在以进行颗粒复制的病毒颗粒)特别有利。