[发明专利]一种利用纳米电穿孔和其他非内吞的细胞转染制备治疗性外泌体的方法

权利要求书

1.一种大量制备含有高拷贝功能性核酸和其他生物分子的治疗性细胞外囊泡(EV)的方法，包括以下步骤：

将供体细胞放置在芯片的表面上，所述表面具有在其上形成的三维(3D)纳米通道电穿孔(NEP)生物芯片；

将各种质粒、其他转染载体及其组合添加到芯片上的缓冲液中；

对放置在芯片表面顶部的细胞和芯片表面下方的质粒/载体缓冲溶液施加脉冲电场，使细胞受到强烈刺激并将质粒/载体以非内吞的方式递送至细胞中；

收集转染细胞分泌的多个EV。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述纳米通道的直径在50-900nm之间。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述质粒和载体转录mRNA、microRNA、shRNA和其他RNA，和引起蛋白质和其他生物分子在转染细胞中的翻译。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述由转染细胞分泌的多个EV包含转录的mRNA、microRNA、shRNA和其他RNA、和翻译的蛋白质和其他生物分子。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将增强热休克蛋白和其他促进转染细胞中的囊泡形成和胞吐作用的蛋白的表达的方式添加到系统中；其中所述方式包括细胞的热休克处理，或在细胞培养基中添加热休克蛋白。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将增强促进转染细胞外泌体形成的蛋白的表达的方式添加到系统中；其中所述方式包括共转染CD63、CD9和其他DNA质粒。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将多个DNA质粒和其他载体连续地递送至转染细胞，以促进RNA/蛋白质靶标的共定位和EV分泌。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中把诸如DNA质粒、其他转染载体、RNA、蛋白质/肽、小分子药物的外源生物分子封装在细胞内的囊泡中，和通过NEP连续转染供体细胞而作为治疗性EV分泌出来。

9.根据权利要求8所述的方法，其中除了NEP之外，用其他细胞转染方法制备具有相似功效的治疗性EV，所述其他细胞转染方法为向供体细胞提供强烈刺激以促进EV分泌和非内吞的质粒/载体递送，用于实现快速的RNA转录和蛋白质翻译。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述其他细胞转染方法包括基因枪、微注射或纳米注射。

11.根据权利要求8～10中任一项所述的方法，其中将所述质粒和/或其他载体系留在纳米或微米大小的金或其他固体颗粒上，和使用基因枪在气动力的作用下将这些颗粒注射到供体细胞中，以引起强烈的细胞刺激和非内吞的质粒/载体递送。

12.根据权利要求8～11中任一项所述的方法，其中将所述质粒和/或其他载体系留在纳米或微米大小的尖端阵列上，并通过这些尖端挤压供体细胞以引起强烈的细胞刺激和非内吞的质粒/载体递送至供体细胞。

13.一种用于大量制备含有高拷贝功能性核酸和其他生物分子的治疗性细胞外囊泡(EV)的装置，包括：

芯片，所述芯片具有三维(3D)纳米通道电穿孔(NEP)生物芯片和在其上形成的用于接收的缓冲液，所述缓冲液适用于接收质粒和其他转染载体。

14.通过权利要求1-12中任一项所述方法转染的细胞。