[发明专利]一种利用纳米电穿孔和其他非内吞的细胞转染制备治疗性外泌体的方法

说明书

含有高拷贝功能性核酸的治疗性细胞外囊泡(EV)通过将供体细胞放置在芯片表面，将各种质粒、其他转染载体及其组合添加到芯片上的缓冲液中，对放置在芯片表面顶部的细胞和芯片表面下方的质粒/载体缓冲溶液施加脉冲电场，收集转染细胞分泌的多个EV的方法而大量生产。所述芯片表面上具有在其上形成的三维(3D)纳米通道电穿孔(NEP)生物芯片，能够处理大量供体细胞。所述缓冲液适用于接收质粒和其他转染载体。

技术领域

本发明涉及通过将DNA质粒和其他载体非内吞的递送至供体细胞中来制备治疗性细胞外囊泡(EV)，特别是外泌体的方法，所述EV包含功能性信使RNA(mRNA)、microRNA(miR)、短发夹RNA(shRNA)、蛋白质和其他生物分子，其方式是由递送引起的强烈刺激触发供体细胞在细胞内产生大量的囊泡，而DNA质粒和载体的非内吞递送会引起细胞质内快速RNA转录和蛋白质翻译，使这些功能性生物分子在作为EV从供体细胞分泌出来前内源性地封装在囊泡中。

背景技术

细胞外囊泡(extracellular vesicle，EV)包括外泌体、微囊泡和其他囊泡，可由多种细胞分泌。在人体中，1mL血液中有10E12个EV，它们也存在于其他体液中。外泌体为一种纳米囊泡(40-150nm)，而微囊泡的大小为100nm至1微米不等。它们包含编码和非编码RNA及其片段、DNA片段、蛋白质和其他与细胞有关的生物分子。EV及它们的生物分子内容物已被提出作为疾病诊断的生物标记。此外，它们对于肿瘤微环境和循环中的细胞间通讯也具有重要意义。

载有功能性RNA和蛋白质的EV也被提出用于治疗用途的药物和药物载体。为了能在体外和体内将特异性核酸和/或蛋白质递送至靶组织或细胞类型中，需要能够制备具有内源性或外源性治疗性货物(cargo)EV的方法。

近年来，已开发了通过常规的批量电穿孔(BEP)将外源小干扰RNA(siRNA)和shRNA质粒后插入预先存在的外泌体中。尽管已在几种癌症和非癌症疾病的小鼠模型中成功证明了它们的治疗功能，但该方法仍面临许多局限性。首先，将大生物分子(如DNA质粒、mRNA和蛋白质)后插入至纳米大小的外泌体是低效率的。其次，BEP产生的强电场会分解许多外泌体，导致治疗性外泌体的产量较低。此外，许多大生物分子，例如mRNA和蛋白质，外源合成是困难和昂贵的。

如果可以开发出可以用DNA质粒或其他载体转染供体细胞以内源性地产生大量含有治疗性RNA和蛋白质靶标的外泌体或其他EV的新方法是十分理想的。

在早先的美国专利申请14/282630中，我们开发了一种纳米通道电穿孔(NEP)生物芯片，该芯片可通过优良的剂量管控将DNA质粒或其他带电粒子和分子非内吞地递送至单个细胞中。在此，我们证明了NEP可以产生大量含有高拷贝的功能性mRNA和microRNA靶标的治疗性外泌体，而此通过上述后插入法是无法实现。除NEP以外，其他非内吞的递送方法(如基因枪、微/纳米注射等)也可以实现类似的效果，但前提是它们需要提供恰当的细胞刺激和快速的质粒/载体递送。

发明内容

本发明涉及新概念和方法的开发，该新概念和方法利用强烈的细胞刺激，可以将DNA质粒和其他载体非内吞地递送至供体细胞中，从而在转染细胞内形成大量的囊泡和转录的RNA以及翻译的蛋白质。细胞会分泌许多含有特定RNA和具有治疗功能的蛋白质靶标的细胞外囊泡(EV)。

为了证明上述设计概念，制造了三维(3D)NEP生物芯片，其可以用预先指定的DNA质粒转染许多供体细胞，以分泌10～100倍包括外泌体在内的多个EV。这些EV含有比从未转染的供体细胞分泌的EV多数千倍的完整的高拷贝mRNA和miR靶标。

本发明的一个方面为一种制备大量含有高拷贝功能性核酸和其他生物分子的治疗性细胞外囊泡(EV)的方法。这样的方法包括以下步骤：

将供体细胞放置在芯片的表面上，所述表面具有在其上形成的三维(3D)纳米通道电穿孔(NEP)生物芯片；